《Cellular Signalling》：DRAM1 activates microglial pyroptosis and neuroinflammation through TMEM9-mediated lysosomal membrane permeabilization after spinal cord injury
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摘要脊髓损伤（SCI）是一种由严重神经炎症和小胶质细胞焦亡为特征的破坏性病变，但其潜在机制尚未完全阐明。本研究探讨了溶酶体膜蛋白DRAM1在SCI发病中的作用。研究采用了单细胞RNA测序、体内SCI小鼠模型以及体外LPS刺激BV2小胶质细胞，并结合组织病理学评估、运动功能检测
摘要
脊髓损伤（SCI）是一种由严重神经炎症和小胶质细胞焦亡为特征的破坏性病变，但其潜在机制尚未完全阐明。本研究探讨了溶酶体膜蛋白DRAM1在SCI发病中的作用。研究采用了单细胞RNA测序、体内SCI小鼠模型以及体外LPS刺激BV2小胶质细胞，并结合组织病理学评估、运动功能检测和分子相互作用实验。结果显示，SCI后小胶质细胞中DRAM1表达显著上调。在机制上，DRAM1与TMEM9相互作用，调控V-ATPase辅助亚基ATP6AP2的表达，从而诱导溶酶体膜通透化（LMP），损害自噬通量，并促进SCI后小胶质细胞焦亡介导的神经炎症。此外，IGF2BP3作为一种m6A阅读蛋白，识别并稳定m6A修饰的DRAM1 mRNA，从而增强活化小胶质细胞中DRAM1的表达。敲低DRAM1或IGF2BP3可减轻体外小胶质细胞焦亡和炎症反应。一致地，体内实验表明，AAV介导的DRAM1敲低改善了SCI小鼠的运动功能恢复，减小了脊髓损伤面积，并抑制了神经炎症反应。综上所述，这些发现揭示了DRAM1通过TMEM9依赖的方式诱导LMP和自噬通量受损，促进SCI后小胶质细胞焦亡和神经炎症，其表达受IGF2BP3以m6A依赖的方式紧密调控。总之，本研究将DRAM1确定为SCI的新治疗靶点。
引言
SCI是对中枢神经系统的严重致残性损伤，可导致运动、感觉和自主神经功能障碍[1]。根据其病理过程，SCI可分为原发损伤和继发损伤[2]。原发损伤在很大程度上是不可逆的，而继发损伤是一个动态的调控过程[3]。继发损伤的病理特征包括炎症反应、自噬、氧化应激、兴奋性毒性、血管损伤、离子失衡和神经元凋亡[4], [5]。继发SCI是导致SCI后神经功能恶化的最重要原因[6]。然而，调控继发损伤发生和发展的关键分子机制仍然知之甚少。
小胶质细胞介导的神经炎症是继发SCI病理进展的关键驱动因素[7]。近年来，抑制小胶质细胞焦亡被认为是SCI的有效治疗策略[8]。自噬是调控小胶质细胞功能的关键机制，自噬受损已被证明会加重SCI后的神经炎症和运动功能障碍[9]，而增强自噬通量可通过诱导抗炎小胶质细胞表型发挥神经保护作用[10], [11]。对大鼠SCI单细胞转录组数据集GSE213240的分析显示，DNA损伤调控自噬调节因子1（DRAM1）在部分小胶质细胞中高表达。然而，DRAM1是否参与SCI后小胶质细胞焦亡和神经炎症的调控，及其潜在机制仍有待探索。
溶酶体是细胞内的主要降解中心，其功能完整性对于维持细胞稳态和高效的自噬通量至关重要[12]。在自噬晚期，自噬体与溶酶体融合形成自噬溶酶体，其中的包裹货物在此被降解[13]。因此，溶酶体膜的完整性直接决定了这一降解过程的效率。证据表明，LMP是自噬通量受损的关键机制。例如，活性氧（ROS）已被证明可诱导LMP，从而损害溶酶体的降解能力并阻断自噬[14]。值得注意的是，DRAM1已被证明通过招募STOM到溶酶体上直接触发LMP[15]。在SCI的背景下，已观察到组织蛋白酶D（CTSD）的胞内定位发生改变，提示LMP的发生并参与了SCI的病理进展[16]。基于此证据，我们假设DRAM1可能通过诱导SCI后的LMP来调控小胶质细胞自噬。然而，DRAM1是否在SCI后直接介导LMP并随后调控自噬仍有待完全探索。
利用基于BioID2的邻近标记结合质谱的研究揭示，在HEK293T细胞中过表达DRAM1可显著富集其邻近蛋白跨膜蛋白9（TMEM9），提示DRAM1与TMEM9之间可能存在相互作用[17]。然而，这两个分子之间的关系尚未见报道。在功能上，TMEM9已被证明可结合V-ATPase亚基ATP6AP2，从而促进质子泵V-ATPase的组装和活性，驱动囊泡酸化[18]。此外，V-ATPase的过度激活已被证明可介导溶酶体过度酸化，导致LMP和随后的焦亡[19]。这些发现提示SCI后可能的一种机制，即小胶质细胞中上调的DRAM1增强其与TMEM9的结合，导致V-ATPase组装和活性增强。该级联反应可能进一步促进LMP，损害自噬，并促进小胶质细胞焦亡介导的神经炎症。
为了探索SCI后DRAM1上调的机制，利用RM2Target数据库和GSE213240数据集进行了筛选分析，鉴定出m6A阅读蛋白胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白3（IGF2BP3）作为潜在调控因子。m6A修饰调控RNA稳定性，并已被证明参与SCI[20]。IGF2BP3作为一种m6A阅读蛋白，可稳定靶标转录本[21]。然而，IGF2BP3与DRAM1之间的关系尚未见报道，其在SCI中的作用仍不清楚。本研究探讨了IGF2BP3是否通过m6A依赖的方式稳定DRAM1 mRNA，作为DRAM1的上游调控因子，从而促进SCI后的小胶质细胞焦亡。
本研究旨在探讨DRAM1在SCI后小胶质细胞焦亡和神经炎症中的作用及其潜在分子机制。我们探索了DRAM1是否与TMEM9相互作用以调控V-ATPase功能和溶酶体稳态，从而促进LMP并损害自噬通量，最终导致小胶质细胞焦亡和神经炎症。此外，我们考察了m6A阅读蛋白IGF2BP3是否通过稳定m6A修饰的DRAM1 mRNA作为DRAM1的上游调控因子。阐明这一信号轴可能为SCI提供新的见解和潜在治疗靶点。
章节摘要
单细胞数据分析
从基因表达综合数据库（GEO）下载了单细胞RNA测序数据集GSE213240。选取了两个重度SCI样本和两个假手术样本进行分析。使用R包Seurat进行质控和过滤，标准如下：nFeature_RNA在500至8000之间，nCount_RNA大于1000，且线粒体基因百分比（Percent_mt）小于15%。标准化后，使用
SCI后小胶质细胞中DRAM1表达显著上调
为了研究SCI后小胶质细胞的分子变化，分析了GSE213240单细胞RNA测序数据集。经过质控过滤后，使用t-SNE和UMAP进行降维和聚类，并根据经典标志基因的表达进行细胞类型鉴定（图1A），并结合ScType进行自动注释（图1B）。如图1A所示，经典小胶质细胞标志基因Cx3cr1在大量
讨论
SCI是一种严重的中枢神经系统创伤性疾病，常导致永久性感觉和运动功能障碍[23]。继发损伤阶段的神经炎症是SCI病理的关键驱动因素[24]。小胶质细胞作为中枢神经系统的常驻免疫细胞，通过过度活化和随后的焦亡在放大神经炎症和加重组织损伤中发挥着核心作用[8], [25]。本研究旨在探讨
结论
总之，本研究证实DRAM1在SCI后小胶质细胞中显著上调。在机制上，DRAM1与TMEM9相互作用，调控V-ATPase辅助亚基ATP6AP2的表达，诱导LMP和自噬通量受损，进一步促进小胶质细胞焦亡介导的神经炎症。IGF2BP3作为一种m6A阅读蛋白，以m6A依赖的方式稳定DRAM1 mRNA，促使其在SCI后上调。在体内，AAV介导的DRAM1敲低显著
CRediT作者贡献声明
熊智超：项目管理、方法论、形式分析、概念化、撰写——审阅与编辑、撰写——原稿。严广奎：软件、项目管理、方法论、资金获取。吴金法：方法论、形式分析、数据整理、撰写——原稿。许天添：调查研究、形式分析、数据整理、撰写——审阅与编辑。陈江伟：形式分析、数据整理、撰写——审阅与编辑。刘佳明：形式分析，
伦理批准
所有动物实验均按照ARRIVE指南2.0进行，实验方案经南昌大学第一附属医院动物伦理委员会批准（CDYFY-IACUC-202504GR026）。
动物对象
本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。
本研究经南昌大学第一附属医院批准。
（批准号：CDYFY-IACUC-202504GR026）
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。
熊智超|严广奎|吴金法|许天添|陈江伟|刘佳明|杜留学
南昌大学第一附属医院骨科医院，中国 南昌 330006
