用于活体表征的可变焦双通道近红外-I/II荧光介观成像技术

《Biosensors and Bioelectronics》：Zoomable dual-channel NIR-I/II fluorescence mesoscopy for in vivo characterization

　　

1 ZD-FMI系统克服了分辨率与视场之间的权衡难题，实现了从厘米级全器官筛查到微米级病变表征的无缝成像。2 NIR-I通道为浅表成像提供更高分辨率，而NIR-II通道在深部组织成像中提供更优的深度穿透能力和信背比。3 在胆汁淤积性肝损伤模型中，利用IR780和ICG，该系统实现了宏观、微结构与功能的一体化评估，且与血清生物标志物结果一致。4 该系统具备可调视场和无漂移变焦能力，适用于手术导航与肿瘤切除引导，同时克服了当前活体内成像的局限，可广泛适用于多样化的临床前与临床跨尺度、多深度成像应用。

引言

荧光成像凭借其卓越的灵敏度、高分辨率以及实时动态监测能力，已成为生物与医学领域不可或缺的技术[1],[2],[3],[4],[5],[6]。它是可视化生物过程、辅助疾病诊断、药物研发以及基础生命机制研究的重要工具，从而推动了精准医学、分子成像与生物传感等领域的变革性进展[5],[6],[7],[8],[9],[10]。然而，两个关键局限限制了当前荧光成像系统在复杂活体场景中更广泛的应用。

首先，受探测器检测范围的局限，现有系统通常仅在单一近红外（NIR）光谱窗口工作，未能利用不同近红外波段的优势互补。NIR-I窗口（780–900 nm）得益于成熟的探针技术（例如已获临床批准的吲哚菁绿（ICG））[11],[12],[13]以及高量子效率，可实现浅表组织的高分辨率成像。NIR-II窗口（900–1700 nm）具有显著降低的组织散射与自发荧光，支持数毫米至数厘米深度的深部组织成像[14],[15],[16],[17],[18],[19]，并具备更优的信背比（SBR）[20],[21],[22],[23]。集成互补的近红外通道、发挥各光谱窗口各自的优势，是未来生物医学成像最有前景的发展方向[24],[25],[26]。

其次，传统荧光成像系统面临视场（FOV）与空间分辨率之间的固有权衡，无法满足活体成像既需要宏观组织背景又需要微观病变细节的实际需求。基于低倍镜头的荧光成像系统视场可达厘米至数十厘米范围，广泛用于宏观器官成像与手术导航，但其分辨率通常局限于数百微米[22]。基于物镜的宽场荧光显微镜受物镜特性限制，视场一般仅有数百微米[27],[28]。尽管显微物镜提供了较高的采集效率，但其有限的视场与工作距离带来实际应用上的局限。虽然马赛克成像等策略可以扩展可观察区域，但耗时较多[29]。在实际应用中，尤其是手术导航，既需要器官级视场，也需要细胞级分辨率。若能在不需要复杂定位与操作系统的前提下，将分辨率极限从数百微米提升至数十微米甚至微米级，将为医生带来极大便利。切换不同倍率的物镜是另一种常见解决方案，但会引入操作复杂、通量低以及空间连续性丢失等问题，这对术中成像等时间敏感的临床场景尤其不利。因此，对于既需要在较大范围内筛查和定位微小病变、又需要随后进行高分辨率成像的任务而言，同样需要一种简单、快速、高效的成像方式。例如，FLARE NIR-I术中成像系统在约18英寸的固定工作距离下，实现了从2.2×1.7 cm2到15×11.3 cm2的可调视场，表明固定工作距离的光学变焦本身并非完全新颖的概念[30]。在NIR-II窗口中，Liao等人报道的深度分辨中尺度成像系统通过改变振镜扫描角度来调整视场，无需更换光学部件，最大视场为7.5×7.5 mm2，横向分辨率为6.3 μm。然而，该系统依赖点扫描采集，且主要面向小动物脑微血管的中尺度成像，而非厘米级手术视野的实时导航[31]。其他高分辨率NIR-II显微系统通常采用短工作距离物镜配合振镜或样品台扫描。例如，Wan等人描述的NIR-II共聚焦系统使用工作距离为3.2 mm的红外物镜，通过扫描获取局部高分辨率图像，更适合详细的组织显微观察[32]。相反，临床NIR-II成像系统主要强调在厘米级手术视野中的肿瘤检测，对连续的大尺度到局部视场缩放以及变焦过程中的焦点稳定性关注较少[22]。

肝胆系统是人体内代谢、解毒和消化的核心枢纽，由肝脏、胆囊和胆道组成[33],[34],[35]。NIR荧光成像已成为肝胆应用中的强大诊断工具：ICG增强的荧光成像可实现胆道的实时可视化[36]，而NIR-II荧光成像已成功应用于脂肪肝和肝纤维化的研究[37],[38]。胆汁淤积是一种由胆汁酸代谢障碍引起的临床综合征，若不加治疗可能进展为胆汁淤积性肝损伤，表现为肝细胞坏死、胆管增生及进行性纤维化[39]。临床上，胆汁淤积可能由药物性肝毒性或内镜操作中的医源性胆道损伤引发。该疾病的有效管理依赖于胆汁淤积性肝损伤的准确诊断与纵向监测，从而能够及时启动靶向治疗策略。传统荧光成像策略在同时满足从厘米级全肝筛查到微米级胆管周围血管病变表征的多尺度需求方面存在固有局限。这一根本性缺陷降低了肝胆系统早期和局灶性病变评估的精确度。

为解决上述尚未满足的需求，本文开发了一套可变焦双通道NIR-I/NIR-II荧光中尺度成像系统（ZD-FMI）。该系统集成了两个近红外波段的光学响应，并通过固定焦距、可变视场的光学设计同时解决视场与分辨率的权衡问题：系统在无需调整焦距的情况下，即可在厘米级宏观视场与微米级高分辨率成像之间快速、稳定地切换，消除了传统变焦镜头在倍率切换时带来的焦点漂移风险，尤其适用于手术过程中的动态目标追踪与实时放大观察。双通道检测模块可同时获取两个近红外窗口的互补成像信息，支持在不同组织深度实现高性能成像。我们将该系统应用于胆汁淤积性肝损伤的诊断与治疗反应监测，结果表明其能够满足肝脏与胆道独特解剖结构所提出的多尺度、多深度成像需求，从非侵入性全器官筛查到高分辨率的胆管周围血管病变表征。本工作为胆汁淤积性肝病的结构与功能评估建立了新的技术范式，而固定焦距、可变视场的设计也为开发低成本、高稳定性的活体荧光成像系统提供了新的技术路径，可便捷地推广至其他需要跨尺度、多深度活体荧光成像的临床前与临床场景。

分节摘要

ZD-FMI系统搭建

系统配置如图1（A）所示。为满足大多数生物样本的成像需求，样品台水平安装在三维平移台上，可实现样品聚焦与成像位置的选择。采用808 nm激光作为激发光源，从样品台上方的斜角照射样品。产生的荧光信号经与垂直方向成45°角放置的反射镜反射

ZD-FMI系统

ZD-FMI系统如图1A所示。由独立激光组成的激发模块提供照明。样品台、反射镜和可调焦透镜组成的采集模块负责从样品中获取信号。包含透镜1–3、二向色镜和一体化管镜的分束与中继模块执行分束和中继功能。由滤光片1–2和两个探测器组成的检测模块用于信号

讨论

本工作提出了一种视场可从毫米级到厘米级变化、最佳分辨率可达微米级的ZD-FMI系统。该系统通过透镜调节实现16倍可变放大范围，其可调视场可满足从小组织到大器官等不同尺寸个体的成像需求，从而解决了限制传统荧光成像系统的视场与空间分辨率之间的固有权衡。NIR-I与

结论

总之，ZD-FMI系统为活体生物成像提供了理想方案，无论样品尺寸与分布深度如何均能提供优异性能。此外，它在手术导航方面也展现出巨大潜力。其从厘米级到毫米级的可变成像视场直观地延伸了人眼观察的极限，使解剖结构定位与微米级病变细节观察成为可能。在肿瘤切除中，变焦荧光成像结合

CRediT作者贡献声明

Tianyu Yan：撰写——原稿，方法论，资金获取。Xueli Chen：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿，项目管理，资金获取，概念构思。Yangyang Liu：软件，调查研究。Xinyi Xu：撰写——审阅与编辑，资金获取，概念构思。Daifang Xu：验证，方法论，调查研究，形式化分析。Zhaoyang Cheng：验证，调查研究。Xinyu Wang：撰写——审阅与编辑，撰写——原稿，

伦理批准

第四军医大学实验动物中心福利与伦理委员会批准了动物实验（编号：IACUC20240007）。所有操作严格遵循机构动物研究指南执行。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。

数据可用性

本研究生成和/或分析的数据集可向通讯作者合理申请获取。

资金支持

本工作部分由国家自然科学基金委员会（62275210、62505244）、国家高层次人才计划、国家青年人才计划、陕西省重点研发计划（2024SF2-GJHX-25）、广东省重点领域研发计划（2026B0303010002）、陕西省博士后科研资助项目、西安市科技项目（23ZDCYJSGG0026-2023）以及国家生物大分子实验室资助。

利益冲突声明

作者已声明不存在利益冲突。

Xinyu Wang｜Daifang Xu｜Zhaoyang Cheng｜Yangyang Liu｜Xinyi Xu｜Tianyu Yan｜Xueli Chen