《Veterinary Research Communications》：Mesenchymal stem cells from Cerdocyon thous: in vitro characterization and therapeutic potential
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间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）展现出已在家养物种中被广泛研究的免疫调节和再生特性。然而，对其在野生动物物种中的生物学特性的认知仍然有限，而这对于推进转化研究和保护医学至关重要。因此，本研究旨在从食蟹狐（Cerdocyo
间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）展现出已在家养物种中被广泛研究的免疫调节和再生特性。然而，对其在野生动物物种中的生物学特性的认知仍然有限，而这对于推进转化研究和保护医学至关重要。因此，本研究旨在从食蟹狐（Cerdocyon thous）中分离、特征化并评估其脂肪组织来源的MSCs（adipose tissue-derived MSCs, AT-MSCs）的免疫调节和神经再生潜力。皮下脂肪组织样本采集自五只接受择期手术的健康成年动物，并事先获得了伦理批准。所有程序均按照机构和国家伦理指南进行。研究人员通过酶消化法分离MSCs，进行体外扩增，并根据形态学、免疫表型和中胚层多能性对其进行特征化。在用脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）进行炎症刺激后评估了细胞活力，并通过RT-qPCR评估了免疫调节细胞因子和神经营养因子的基因表达。这些细胞呈现出典型的成纤维细胞样形态、塑料贴壁性、表达间充质标志物CD90、CD29和CD44，不表达造血标志物CD14和CD45，并能成功分化为成脂、成软骨和成骨谱系。LPS刺激显著上调了吲哚胺-2,3-双加氧酶（indoleamine-2,3-dioxygenase, IDO），以及神经营养和再生因子——胶质细胞源性神经营养因子（glial cell line-derived neurotrophic factor, GDNF）、肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）和血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A, VEGF-A）的表达。这些发现表明，源自食蟹狐的AT-MSCs具备免疫调节和神经再生潜力，支持其在转化研究以及未来保护兽医医学应用中的相关性，尤其是在炎症和神经系统疾病的背景下。
研究背景与科学问题
间充质干细胞（MSCs）因其自我更新、特定免疫表型及向中胚层谱系分化的能力而被广泛研究，其免疫调节与再生特性在家养动物（如犬、马、羊等）中已有大量报道。然而，在野生动物领域，对MSCs生物学特性的认知极为匮乏，这限制了转化研究与保护医学的发展。食蟹狐（Cerdocyon thous）是一种广泛分布于南美洲的新热带区杂食性中型食肉动物，随着栖息地破碎化和人类活动加剧，其与家养动物（尤其是犬类）的接触日益频繁，导致感染具有中枢神经系统嗜性的病原体（如犬瘟热病毒，CDV）的风险升高。犬瘟热可引发严重的脱髓鞘病变和神经功能障碍，而目前针对野生犬科动物的有效治疗手段十分有限。尽管MSCs在治疗神经系统疾病方面展现出巨大潜力，但迄今为止，尚无研究描述或特征化来自食蟹狐的MSCs。因此，开展此项研究旨在填补这一空白，评估食蟹狐脂肪组织来源的MSCs（AT-MSCs）的抗炎、免疫调节及神经再生潜能。
研究方法概述
研究人员从巴西圣保罗州立大学兽医学院野生动物医学与研究中心的5只健康成年食蟹狐（3雌2雄）腹部皮下脂肪组织中，通过酶消化法分离并体外扩增AT-MSCs。采用流式细胞术检测表面抗原（CD90、CD29、CD44、CD14、CD45）以进行免疫表型鉴定，并通过定向诱导分化（成脂、成软骨、成骨）验证其中胚层多能性。随后，用10 ng/mL脂多糖（LPS）模拟炎症环境刺激细胞24小时，通过台盼蓝拒染法评估细胞活力，并利用RT-qPCR技术检测12种免疫调节细胞因子及神经营养因子的基因表达变化。
研究结果
1. 分离、培养与特征化
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形态与免疫表型：培养的细胞呈现典型的长梭形成纤维细胞样形态，贴壁生长。流式细胞术显示，细胞高表达间充质标志物CD90（98.02%）、CD29（99.99%）和CD44（99.81%），而几乎不表达造血标志物CD14（1.60%）和CD45（1.81%）。
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多能性分化：在特定诱导条件下，细胞成功分化为成脂细胞（油红O染色阳性，胞内脂滴积累）、成软骨细胞（阿尔新蓝染色阳性，糖胺聚糖沉积）和成骨细胞（茜素红染色阳性，矿化基质形成）。
2. 炎症刺激后的形态与活力
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LPS刺激24小时后，细胞仍保持典型成纤维细胞样形态，且两组细胞活力均维持在极高水平，无统计学显著差异（p = 0.1584），表明所用浓度的LPS未产生细胞毒性效应。
3. 基因表达分析
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神经营养与再生因子：与对照组相比，LPS刺激组中胶质细胞源性神经营养因子（GDNF）和肝细胞生长因子（HGF）的表达显著上调（p = 0.0004；p = 0.0103）。脑源性神经营养因子（BDNF）表达无显著变化。
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免疫调节因子：LPS刺激显著上调了吲哚胺-2,3-双加氧酶（IDO）的表达（p < 0.0001）。同时，促血管生成因子血管内皮生长因子A（VEGF-A）也显著升高（p < 0.0001）。
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其他细胞因子：白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-1β（IL-1β）、干扰素-γ（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及前列腺素E合酶2（PTGES2）的表达在两组间无统计学差异。
讨论与结论总结
讨论部分指出，这是首次对食蟹狐MSCs进行的系统性描述与特征化研究。所获得的AT-MSCs完全符合国际细胞治疗学会（ISCT）定义的MSCs最低标准。研究观察到，LPS刺激并未触发经典的促炎反应，而是激活了一种偏向免疫调节的功能模式。IDO的强烈上调是关键发现，其作为色氨酸分解代谢的关键酶，可通过消耗局部色氨酸并产生代谢产物抑制T淋巴细胞增殖，从而促进免疫耐受。尽管在犬类MSCs中IDO并非主要的免疫抑制机制，但其上调仍是细胞被“炎症驯化”的证据。此外，GDNF和HGF的显著增加，连同VEGF-A的上调，共同指向了MSCs通过旁分泌作用支持神经元存活、轴突再生和改善组织灌注的神经保护和修复潜力。这些结果表明，食蟹狐AT-MSCs能够在炎症环境下协调免疫调节与组织修复信号。
研究结论：基于所得结果，食蟹狐的AT-MSCs表现出符合MSCs特征的形态学和免疫表型，包括成纤维细胞样形态、间充质标志物的表达、造血标志物的缺失、成脂、成软骨和成骨分化能力，以及在炎症刺激下维持活力的特性。此外，LPS暴露调节了与免疫调节和再生机制相关的基因表达，表现为IDO以及神经营养和血管生成因子（如GDNF、HGF和VEGF-A）的显著上调。这些发现首次提供了对食蟹狐AT-MSCs的特征化描述，并证明了它们在体外响应炎症刺激、调节与免疫调节和神经再生通路相关基因表达的能力。这些结果为MSCs在保护兽医医学中的应用，特别是针对炎症性和神经系统疾病，奠定了功能特性和潜在应用的基础。
