《Acta Neuropathologica》：Integrative synaptosome multi-omics reveals disrupted synapse organization and localized cryptic transcripts in C9ORF72-frontotemporal dementia
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额颞叶痴呆（FTD）与肌萎缩侧索硬化（ALS）是相互关联的神经退行性疾病，以突触功能障碍和TDP-43病理为共同特征。C9ORF72（C9）基因中的六核苷酸重复扩增（HRE）是FTD和ALS最常见的遗传病因，然而疾病发病机制中突触特异性的分子机制仍知之甚少。研
额颞叶痴呆（FTD）与肌萎缩侧索硬化（ALS）是相互关联的神经退行性疾病，以突触功能障碍和TDP-43病理为共同特征。C9ORF72（C9）基因中的六核苷酸重复扩增（HRE）是FTD和ALS最常见的遗传病因，然而疾病发病机制中突触特异性的分子机制仍知之甚少。研究人员对取自死后额叶皮层和患者来源诱导多能干细胞（iPSC）皮层神经元的富集突触体进行了整合多组学分析，以界定与C9-FTD介导的突触功能障碍相关的分子改变。基于额叶皮层来源突触体的蛋白质组学分析鉴定了1,324个差异丰度蛋白（p<0.05），这些蛋白富集于调控突触囊泡运输和突触组织的信号通路；而突触体RNA测序则揭示了2,835个差异表达蛋白编码基因。C9-FTD iPSC皮层神经元表现出兴奋性和抑制性突触后标志物减少，并伴随神经元网络活动的进行性损害，支持结构与功能双重缺陷的存在。iPSC来源突触体重现了在患者大脑中观察到的关键分子通路，揭示了突触信号通路的汇聚性失调。比较分析显示蛋白与RNA改变之间存在差异，与疾病突触中连接RNA和蛋白丰度的调控过程被破坏相一致。与TDP-43功能缺失病理一致，研究人员在C9-FTD额叶皮层来源突触体中鉴定出含有隐密外显子（CE）的转录本，包括KALRN和STMN2，为异常剪接RNA定位于突触区室提供了证据。综上，这些发现定义了C9-FTD两种模型系统中突触易感性背后的汇聚分子通路，并将含CE转录本的突触定位确定为TDP-43蛋白病此前未被识别的特征。
额颞叶痴呆（frontotemporal dementia，FTD）是一种进行性神经退行性疾病，以额叶和颞叶选择性退行性变为特征，临床表现为行为异常、执行功能障碍和语言损害，目前尚无改善疾病的治疗方法。约20–25%的FTD病例由致病性突变引起，其中最常见的遗传病因是C9ORF72基因（C9）中的六核苷酸重复扩增（HRE）。C9-HRE同时是FTD和肌萎缩侧索硬化（ALS）最常见的遗传病因，由此确立了FTD–ALS临床与病理谱系的概念。在机制层面，C9-HRE通过功能缺失和毒性功能获得两种机制参与发病，包括C9ORF72蛋白单倍剂量不足、毒性RNA形成核内 foci以及通过重复相关非AUG（RAN）翻译产生二肽重复（DPR）蛋白。FTD–ALS谱系中一个汇聚性的病理标志是RNA结合蛋白TAR DNA结合蛋白43（TDP-43）的异常定位和聚集。在C9-HRE相关疾病中，TDP-43从细胞核中耗竭并错误定位至细胞质，导致RNA调控功能丧失。TDP-43功能缺失的一个关键后果是异常RNA剪接，包括基因转录本中隐密外显子（CE）的去抑制，其中许多基因调控突触生物学功能。既往研究已在UNC13A和STMN2中鉴定到CE包含，后续在ALS/FTD患者组织和TDP-43缺失的iPSC来源神经元中的分析又发现了包括KALRN在内的其他突触靶点，支持TDP-43功能缺失优先破坏对突触功能至关重要的RNA程序这一新兴概念。突触功能障碍及随之而来的突触丢失是包括FTD在内的神经退行性疾病中一致的病理标志。来自FTD患者神经影像学研究和死后大脑病理评估的证据均支持进行性皮层连接性下降和突触退行性变的存在。为研究突触特异性分子变化，分离的突触区室（突触体）已被广泛用于蛋白质组学和转录组学分析。尽管既往C9-ALS研究报道了运动和前运动皮层中的区域突触异常，但C9-FTD中突触功能障碍的分子 landscape 仍未明确。为此，研究人员通过整合死后额叶皮层组织和患者来源iPSC分化皮层神经元两种模型系统，对C9-FTD突触体进行了蛋白质组学和转录组学联合分析。研究在死后脑组织突触体中鉴定了1,324个差异丰度蛋白和2,835个差异表达蛋白编码转录本，这些改变汇聚于突触囊泡动态、神经递质释放和突触组织相关通路。iPSC来源皮层神经元表现出兴奋性和抑制性突触后标志物减少及抑制性突触密度下降，并伴有神经元放电活动的进行性降低。iPSC来源突触体的多组学分析显示其重现了死后额叶皮层组织突触体中的关键分子通路，支持该模型用于研究细胞自主性突触异常的适用性。尤其重要的是，研究人员首次证明TDP-43相关的异常剪接mRNA存在于人类突触区室中，进一步将RNA错误加工与突触病理联系起来。
以下为论文解读文章：
**研究背景与科学问题**
额颞叶痴呆（frontotemporal dementia，FTD）与肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是同一临床病理谱系两端、相互关联的神经退行性疾病，二者共享突触功能障碍与TDP-43病理特征。C9ORF72基因（C9）中的六核苷酸重复扩增（hexanucleotide repeat expansion，HRE）是FTD和ALS最常见的遗传病因，但其突触特异性的发病机制仍不清楚。TDP-43功能缺失导致的异常RNA剪接——特别是隐密外显子（cryptic exon，CE）的异常包含——已被认为是TDP-43蛋白病的核心分子事件之一，既往研究发现STMN2、UNC13A、KALRN等 synaptic 靶基因的CE异常剪接。然而，这些异常剪接的RNA是否存在于突触区室并在局部发挥作用，此前尚无报道。此外，尽管突触功能障碍是FTD的早期病理事件，但C9-FTD中突触特异性的分子 alterations 的完整 landscape 仍属空白。因此，研究人员开展了整合多组学分析，以系统解析C9-FTD突触的分子病理机制。
**研究技术与方法概述**
研究人员使用了来自伦敦大学学院皇后广场脑库（Queen Square Brain Bank，QSBB）的死后额叶皮层组织样本（C9-FTD与正常对照各10例）以及由患者来源iPSC分化而成的皮层神经元模型（C9-FTD与对照各3例细胞系）。关键技术方法包括：采用差速离心生化分级分离法从死后脑组织和iPSC皮层神经元中富集突触体（synaptosome）P2组分，并通过透射电子显微镜（transmission electron microscopy，TEM）和western blot验证突触富集效果；利用基于质谱的定量蛋白质组学（液相色谱串联timsTOF质谱，diaPASEF模式）分析蛋白组；利用RNA测序分析转录组；采用隐密外显子剪接连接分析（基于STAR比对和regtools/Leafcutter流程）检测CE包含事件并计算百分比剪接指数（percentage spliced in，PSI）；通过免疫荧光染色和定量分析评估突触前后标志物 puncta 密度；采用微电极阵列（multielectrode array，MEA）进行纵向神经元网络功能记录。
**主要研究结果**
*成功富集脑突触体中的突触蛋白和RNA。* 通过western blot检测突触前标志物Synaptophysin（SYP）和突触后标志物Homer1证实P2组分富含突触成分；TEM显示了包含突触囊泡和电子致密突触后物质的膜包裹突触前末端，证明分离的突触体结构完整。主成分分析（PCA）显示H0与P2组分在蛋白质组和转录组层面均明显分离。SynGO数据库定义的突触蛋白在P2组分中富集，而核相关标志物在P2中缺失，证明成功富集了突触材料。
*突触体蛋白质组学揭示C9-FTD中突触选择性分子改变。* 对额叶皮层匀浆和突触体进行质谱蛋白质组学分析，在突触体组分中鉴定出1,324个差异丰度蛋白（differentially abundant proteins，DAPs，p<0.05），其中555个上调、769个下调。SynGO生物学过程富集分析显示，下调蛋白显著富集于突触囊泡循环、化学突触传递、跨突触信号等通路；上调蛋白富集于突触组装调控、突触结构修饰等通路，提示C9-FTD中突触架构发生广泛重塑。
*突触体转录组学揭示广泛的RNA失调及转录组-蛋白质组差异。* 突触体RNA测序鉴定出2,835个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs），包括1,763个上调和1,072个下调转录本。SynGO富集分析显示下调基因显著富集于突触囊泡循环、突触囊泡胞吐、化学突触传递等通路。RNA与蛋白log2FC相关性分析显示仅中等程度相关（Pearson r=0.33），38.7%的基因呈现RNA-蛋白方向不一致的改变，提示疾病突触中存在转录后调控的解偶联。
*C9-FTD iPSC皮层神经元在体外表现出结构和功能突触缺陷。* 免疫荧光定量分析显示，C9-FTD皮层神经元中兴奋性突触后标志物Homer1和抑制性突触后标志物Gephyrin的puncta密度均显著降低，而突触前标志物VGLUT1和VGAT密度无差异；共定位分析显示抑制性突触密度选择性降低，兴奋性突触密度不变。纵向MEA记录显示C9-FTD神经元自发放电活动在DiV65至DiV100期间进行性下降，而网络同步性无显著差异，表明存在进行性神经元低兴奋性表型。
*iPSC神经元来源突触体重现C9-FTD额叶皮层中观察到的疾病相关通路。* 对iPSC皮层神经元突触体进行蛋白质组学分析，鉴定出962个DAPs（508个上调、454个下调）；转录组分析鉴定出402个蛋白编码DEGs（138个上调、264个下调）。SynGO富集分析显示下调蛋白和基因富集于化学突触传递、突触后细胞骨架组织等通路，与死后脑组织观察到的通路改变高度重叠，证明该模型能够重现C9-FTD突触功能障碍的关键分子特征。
*跨模型多组学整合鉴定C9-FTD突触功能障碍的保守通路。* 对额叶皮层和iPSC来源突触体的蛋白质组和转录组四个数据集进行整合分析。UpSet图显示多个基因和蛋白在至少三个数据集中一致改变。SynGO富集分析揭示共享的突触组装、突触组织和跨突触信号等生物学过程，整合热图显示这些保守通路中的top 25基因在RNA和蛋白层面均保持一致的改变方向，支持这些是C9-FTD相关突触功能障碍的高置信度候选分子。
*隐密外显子分析揭示TDP-43相关隐密外显子包含转录本在C9-FTD中的突触定位。* 在C9-FTD突触体中通过IGV sashimi plot检测到STMN2和KALRN基因的CE包含剪接连接。PSI定量显示STMN2的CE包含在C9-FTD中显著增加（p=0.0007），KALRN显示病例依赖性变异但组间无显著差异（p=0.1462），UNC13A的CE转录本在突触体组分中未检测到（p>0.9999）。STMN2显示出最高的相对突触富集（P2:H0比值=0.8571），而UNC13A的突触定位极低（P2:H0=0.0769）。这些CE包含事件发生在总转录本或蛋白丰度无明显变化的情况下，提示局部剪接异常独立于稳态表达变化。
**讨论与结论**
研究人员在讨论中指出，本研究通过整合死后脑组织和iPSC模型的多组学数据，揭示了C9-FTD突触中广泛的分子重塑。与C9-ALS中观察到的神经元高度兴奋性不同，C9-FTD皮层神经元表现为进行性低兴奋性，可能与神经元亚型特异性脆弱性有关。突触后标志物的选择性减少和抑制性突触密度的下降提示突触后组织受损是功能缺陷的结构基础。NPTX1、NPTX2、NPTXR等突触相关基因的一致下调与FTD患者脑脊液生物标志物研究结果相符。最关键的发现是CE包含转录本存在于突触区室且具有转录本特异性：STMN2显示出最强的突触富集，而UNC13A几乎不定位至突触，提示异常剪接RNA的突触定位不是一种普遍性的再分布，而是转录本特异的转运或稳定性差异。研究人员同时指出，突触体分离无法完全排除非突触成分污染，且本研究仅针对已知TDP-43依赖性CE进行了分析，CE转录本是否在突触局部进行翻译以及其功能后果仍需进一步研究。
**研究结论**
本研究的整合突触体多组学分析揭示了C9-FTD突触的广泛分子重塑。死后额叶皮层组织和患者来源iPSC皮层神经元中发现的汇聚性证据支持突触功能障碍是C9-FTD发病中早期且具有生物学相关性的特征。重要的是，CE包含转录本在突触区室的定位扩展了TDP-43功能障碍的现有模型，将异常剪接RNA的作用延伸至局部突触缺陷。这些发现共同确立了突触作为C9-FTD中亚细胞脆弱性位点的地位，并为未来旨在恢复TDP-43相关神经退行性疾病突触完整性的研究提供了框架。该研究发表在《Acta Neuropathologica》。
