《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：DDX3X regulates DNA repair pathway choice at double-strand breaks via RNA-DNA hybrid formation
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DNA双链断裂（DSBs）是最具细胞毒性的DNA损伤之一。在DSB处理过程中，会产生所谓断裂诱导RNA-DNA杂交体（Break-Induced RNA-DNA Hybrids, BIRDHs）以促进DSB的及时修复。研究人员鉴定出DEAD-box解旋酶DDX
DNA双链断裂（DSBs）是最具细胞毒性的DNA损伤之一。在DSB处理过程中，会产生所谓断裂诱导RNA-DNA杂交体（Break-Induced RNA-DNA Hybrids, BIRDHs）以促进DSB的及时修复。研究人员鉴定出DEAD-box解旋酶DDX3X是BIRDHs的正向调节因子，也是通过同源重组（Homologous Recombination, HR）促进DSB修复的关键因子。研究人员证明，DDX3X通过在Drosha依赖的方式下限制53BP1在DSB处的积累，抑制CST（CTC1、STN1、TEN1）-Polα填充合成，从而促进BIRDH形成。值得注意的是，DDX3X耗竭会损害BIRDH和BRCA1焦点形成，而在DDX3X缺陷细胞中失活CST-Polα介导的填充合成可恢复这些事件。这表明BIRDH形成与填充合成之间存在竞争互作，影响DNA修复通路选择。与DDX3X在HR中的作用一致，DDX3X耗竭在体外和体内使肿瘤细胞对顺铂增敏。研究人员得出结论：DDX3X通过调控BIRDHs，在DSB形成后促进基因组维持和细胞存活。
研究背景方面，双链断裂（DSBs）是威胁基因组完整性与细胞生存的最严重DNA损伤类型。细胞主要依赖同源重组（HR）与非同源末端连接（NHEJ）修复DSBs；HR多见于S/G2期且保真度高，NHEJ全周期活跃但易错。53BP1通过RIF1和shieldin促进NHEJ并拮抗BRCA1依赖的末端切除，其下游CST-Polα复合物可进行填充合成（fill-in synthesis）以保护DNA端并偏向NHEJ。近年研究发现，损伤位点可产生损伤诱导长链非编码RNA（dilncRNAs）与DNA损伤应答小RNA（DDRNAs），并形成断裂诱导RNA-DNA杂交体（BIRDHs）来促进HR；但BIRDH形成如何与末端填充合成协调、从而决定HR/NHEJ选择仍不清楚。该论文发表于《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》，研究人员通过RNA-DNA邻近蛋白质组学筛选锁定DDX3X，证明其正向调控BIRDH、限制53BP1-CST-Polα轴，使修复偏向HR，并发现DDX3X缺失使肿瘤细胞内顺铂敏感性增加，具有重要意义。
关键技术方法方面，研究人员使用RNaseH1死突变体（RH1-D210N）-TurboID/StrepII邻近标记联合质谱筛选DSB相关RNA-DNA杂交体互作蛋白；采用激光微辐射与FokI/lacO阵列、AsiSI（DIvA系统）诱导位点特异性DSB；用S9.6免疫荧光、R-ChIP与DRIP-qPCR检测BIRDH；用DR-GFP等报告系统定量HR、NHEJ、SSA与MMEJ；用auxin-inducible degron（mAID）快速降解内源DDX3X；用CD437抑制Polα及STN1敲低阻断CST-Polα填充合成；样本主要为U2OS、HEK293、HCT-116等细胞系。
研究结果如下。RNaseH1-TurboID identifies DDX3X as a key factor of HR repair：研究人员通过RH1-D210N-TurboID质谱筛选发现DDX3X等DExD/H盒RNA解旋酶在CPT或Zeocin处理后富集；DDX3X耗竭导致残留γH2AX焦点增多、染色体断裂/缺口加倍、BRCA1与RAD51焦点下降、DR-GFP的HR频率降至约39%、AAVS1位点突变频率升高，表明DDX3X是HR修复重要调节因子。DDX3X is required for BIRDH formation：研究人员用RH1-D210N-GFP、S9.6染色、lacO阵列与DIvA/R-ChIP证明，DDX3X耗竭使BIRDH水平降至约40%–61%，回补野生型而非解旋酶死亡K230E突变体可恢复，说明DDX3X以解旋酶活性促进BIRDH形成。 Inhibiting 53BP1-associated CST-Polα-mediated fill-in synthesis restores BIRDH and HR repair in DDX3X-depleted cells：研究人员发现DDX3X耗竭减少RPA焦点，共敲低53BP1或用CD437抑制Polα、敲低STN1可恢复BIRDH、BRCA1招募与HR效率，表明DDX3X通过限制53BP1-CST-Polα填充合成来维持BIRDH与HR。 BIRDHs antagonize CST-Polα-mediated fill-in synthesis to promote HR repair：研究人员用RNase H1过表达、RNase H2A敲低及EdU填充合成检测证明，RNA-DNA杂交体本身抑制CST-Polα填充合成并促进末端切除；DDX3X野生型回补降低填充合成，K230E不能；Polα抑制或STN1缺失增强CPT诱导的有丝分裂DNA合成（MiDAS），DDX3X缺失则消除MiDAS。 DDX3X restricts 53BP1 accumulation at DSBs：研究人员显示DDX3X耗竭使53BP1、RIF1在DSB处积累约2.3–4.5倍；EMSA表明野生型DDX3X可把53BP1从RNA复合物上置换下来，K230E不能；体内RIP显示DDX3X耗竭增加53BP1与dilncRNA/DDRNA结合，过表达野生型DDX3X降低该结合并减少53BP1焦点。 AGO2 is required for the efficient recruitment of DDX3X to DSBs：研究人员发现Drosha耗竭、RNAPII转录抑制会降低DDX3X向激光DSB募集；AGO2参与DDX3X的RNA依赖型招募，说明DDX3X定位受DDRNA-AGO2轴调控。
讨论与结论部分总结：研究人员指出，BIRDH形成与CST-Polα填充合成竞争同一3′单链DNA（ssDNA）底物；DDX3X位于Drosha/DDRNA下游，借助解旋酶活性置换53BP1与损伤RNA的关联，削弱53BP1-RIF1-shieldin-CST-Polα轴，从而保护3′ ssDNA overhang、促进BIRDH积累与BRCA1/RAD51招募，使DSB修复转向HR。结论为：DDX3X promotes genome maintenance and cell viability following DSB formation through regulation of BIRDHs，即DDX3X通过调控断裂诱导RNA-DNA杂交体，在DSB形成后促进基因组维持与细胞存活；其为HR偏向性修复提供了新的RNA-蛋白调控节点，并提示DDX3X可作为增强铂类化疗敏感性的潜在靶点。
