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饮食作为影响衰老与预期寿命的环境因素，与年龄相关的DNA甲基化（DNA methylation, DNAm）和表观遗传时钟（epigenetic clocks）是衰老的主要标志物，并可能受饮食调节。然而，饮食与表观遗传时钟之间的观察性关联可能受到家族因素混杂。
饮食作为影响衰老与预期寿命的环境因素，与年龄相关的DNA甲基化（DNA methylation, DNAm）和表观遗传时钟（epigenetic clocks）是衰老的主要标志物，并可能受饮食调节。然而，饮食与表观遗传时钟之间的观察性关联可能受到家族因素混杂。研究人员利用丹麦GEMINAKAR队列中1997–2000年建立、参与时年龄18–67岁、并完成12年随访的单卵双生子（monozygotic, MZ）数据，检验对丹麦饮食指南的依从性是否与独立于此类混杂的表观遗传年龄相关联。研究人员在两个时间点均通过食物频率问卷（food frequency questionnaire, FFQ）评估膳食摄入，并采用丹麦饮食指数（Danish Dietary Index, DDI）量化依从性。表观遗传年龄使用既有时钟（PCHannum、PCHorvath1、PCPhenoAge及PCGrimAge）和DunedinPACE进行估计。研究人员采用线性回归模型开展个体水平分析和双生子对内分析以控制家族因素，并同时评估横断面与纵向关联。对共享几乎所有分离基因且经历相同早期环境暴露的单卵双生子的分析，使研究人员得以在双生子对内分析中控制遗传和共享环境因素。在横断面个体分析中，对饮食指南更高的依从性与更低的表观遗传年龄（衰老）相关，尤其表现为每增加1个单位指数得分，PCGrimAge降低0.55–0.67岁，DunedinPACE衰老速度降低3.1%。然而，这些关联在双生子对内和纵向分析中有所减弱，提示其可能由遗传和共享环境因素解释。总体而言，研究结果不支持存在强烈的独立关联，但表明饮食依从性对表观遗传衰老的表现获益可能部分反映家族因素。
一、研究背景、问题与开展意义
随着全球人口老龄化加剧，维持身心健康的重要性日益凸显。遗传和环境因素共同决定终身健康衰老轨迹。饮食作为影响衰老与预期寿命的环境因素，可通过调节非传染性疾病风险发挥作用。表观遗传机制，特别是DNA甲基化，动态参与基因表达调控和细胞功能，构成生物衰老的主要标志物之一。基于年龄相关DNA甲基化模式开发的表观遗传时钟，如第一代Horvath和Hannum时钟、第二代PhenoAge、GrimAge及DunedinPACE，被广泛用作生物衰老的生物标志物。表观遗传年龄加速（epigenetic age acceleration, EAA）与增龄相关疾病和死亡风险升高稳定相关。
既往横断面研究提示健康饮食模式与表观遗传年龄减速之间存在负向关联，即饮食越健康，生物学年龄相对时间年龄越年轻。随机对照试验（randomized controlled trial, RCT）也支持健康饮食干预可减缓表观遗传衰老。然而，观察性研究固有混杂问题难以完全克服，统计调整仅限于已知且可测量混杂因素，未测量或残余混杂仍可能导致关联被高估。RCT并非在所有情境下可行。双生子研究为控制遗传和共享环境混杂提供了替代途径。饮食和表观遗传衰老均显示部分受遗传决定，遗传混杂在逻辑上存在可能。在单卵双生子对内分析中，可完全控制遗传混杂和共享环境混杂。然而，饮食与表观遗传年龄加速之间的关联究竟在多大程度上归因于遗传等未测混杂因素，目前尚不清楚。基于此，研究人员利用丹麦GEMINAKAR双生子队列中纵向饮食和DNA甲基化数据，采用个体水平和双生子对内分析方法，评估丹麦饮食指南依从性与五种表观遗传年龄加速及衰老速率标志物（PCHannum、PCHorvath1、PCPhenoAge、PCGrimAge和DunedinPACE）的横断面和纵向关联，以探索遗传和共享环境因素在该关系中的潜在混杂作用。
二、研究内容与主要结论
研究人员对132对完整单卵双生子（共264人）进行了分析。研究结果表明，在基线横断面个体水平分析中，较高的饮食指南依从性与较低的表观遗传年龄加速相关，尤其体现在PCGrimAge和DunedinPACE上。每增加1个单位DDI得分，PCGrimAge降低0.55–0.67岁，DunedinPACE衰老速度降低3.1%。然而，这种负向关联在双生子对内横断面分析中明显减弱，提示遗传和共享环境因素可能解释个体水平估计中的部分关联。纵向分析中，大多数估计值为正，即饮食评分改善反而与表观遗传年龄加速增加相关，但置信区间较宽，结果应谨慎解释。总体而言，该研究不支持饮食依从性与表观遗传衰老之间存在强独立关联，提示表观获益可能部分反映家族因素。该研究的意义在于，通过单卵双生子对内设计有效控制遗传和共享环境混杂，为理解饮食与表观遗传衰老关联的性质提供了更严格的因果推断证据，凸显了在营养流行病学中使用家族设计控制未测量混杂的重要性。
三、主要关键技术方法
研究人员使用丹麦GEMINAKAR双生子队列数据。该队列1997–2000年经丹麦双生子登记处（Danish Twin Registry, DTR）建立，参与者基线年龄18–67岁。本研究仅纳入基线及随访均具有完整FFQ、DNA甲基化数据及协变量数据的单卵双生双胞胎，共132对。DNA甲基化采用Illumina Infinium MethylationEPIC BeadChips芯片检测，通过meffil R包进行质量控制与归一化处理。饮食摄入使用经验证的192项半定量FFQ评估，采用FOODCalc软件计算每日食物和营养素摄入量。丹麦饮食指数依据2013年国家食品指南构建，纳入六项指南评分相加，理论范围为0–6分。表观遗传年龄通过Higgins-Chen等提供的R脚本计算PC时钟，DunedinPACE按Belsky方法计算。统计分析采用混合效应线性回归进行个体水平分析，固定效应线性回归进行双生子对内分析，调整性别、年龄、身体质量指数（body mass index, BMI）、吸烟和体力活动等协变量。
四、研究结果
（一）参与者特征与描述性结果
共264名单卵双生子纳入分析，基线平均年龄36岁，全部为白人，女性占54%。DDI评分达≥4者85人（32%），评分≥5者18人，仅1人获得满分6分。高依从组参与者倾向于年龄更大、女性比例更高、不吸烟且体力活动水平更高，但总胆固醇和血压水平也高于低依从组。从基线到随访，DDI评分均值略增，表观遗传年龄增幅（7.6–8.8年）低于时间年龄增幅（12年），各时钟与时间年龄的相关系数稳定在0.84–0.96之间。
（二）横断面个体水平分析
基线个体水平分析中，所有β值均为负值，即饮食指南依从性越好，表观遗传年龄加速或衰老速度越低。这种负向关联在PCGrimAge（每单位DDI变化对应0.55–0.67年减速）和DunedinPACE（表观衰老速度降低3.1%）上尤为明显。随访数据的横断面个体分析也呈现相似的负向趋势。
（三）横断面双生子对内分析
与个体水平分析不同，基线双生子对内分析未显示饮食依从性与表观遗传年龄加速之间存在强关联。这表明个体水平估计中的负向关联可能受遗传和共享环境因素混杂影响。但在随访数据中，除PCPhenoAge外，大多数时钟的估计值为负，不过置信区间较宽。
（四）纵向分析
纵向个体水平和双生子对内分析中，大多数估计值为正，即基线至随访期间饮食评分改善（对饮食指南依从性提高）反而与表观遗传年龄加速或衰老速度增加相关。这一结果与横断面分析方向相反，置信区间较宽，研究人员认为该模式出乎意料，并计划通过亚组分析解析其成因，但当前样本量不足以支持进一步探索。
（五）协变量调整的影响
从模型1到模型2加入BMI、吸烟和体力活动等协变量后，估计值变化较小，表明这些生活方式相关因素对关联的影响有限。
五、讨论与结论总结
讨论部分指出，个体水平基线横断面结果与既往横断面研究一致，且第二代表观遗传时钟（PCPhenoAge、PCGrimAge、DunedinPACE）所提示的效应比第一代时钟（PCHannum、PCHorvath1）更明显，这与这类时钟富含健康和死亡风险表型信号的特点相符。双生子对内分析中效应减弱，提示遗传和共享环境因素可能是饮食与表观遗传年龄关联的重要混杂来源。由于研究中未纳入异卵双生子对，无法进一步分离遗传与共享环境因素的各自贡献。纵向分析中方向反转的发现提示需要更大样本进行亚组分析。
研究结论为：总体未观察到强关联。横断面个体水平分析表明，对以增加水果、蔬菜、豆类和全谷物摄入、减少红肉和加工肉类摄入为特征的丹麦饮食指南的更高依从性，与PCGrimAge和DunedinPACE评估的表观遗传衰老减速有关。但相应的双生子对内分析及纵向分析中未见该关联，提示饮食与表观遗传年龄之间观察到的关联可能受到遗传或共享环境因素混杂，尽管这有待更大规模研究加以证实。
