口服诺如病毒VP1表达家蚕蛹可食用疫苗候选的免疫原性研究

《Vaccine》：Immunogenicity of norovirus VP1-expressing silkworm ( Bombyx mori) pupae as an edible vaccine candidate

　　

诺如病毒（Norovirus, NV）是全球急性胃肠炎的主要病原体，大多数个体一生中预计经历3–8次NV感染，且至少一次发生在5岁之前。幼儿和老年人尤其易患严重疾病。全球范围内，NV感染每年导致约20万人死亡，其中低收入和中等收入国家儿童死亡人数超过7万人。除沉重的健康负担外，NV感染相关的直接医疗费用估计每年达42亿美元（95%不确定区间[UI]：32–57亿美元），社会总成本约达603亿美元。这一沉重负担凸显了对NV感染有效预防策略的需求，然而目前尚无获许可的疫苗。 NV是一种直径约40 nm的无包膜病毒，属于杯状病毒科（Caliciviridae），具有正链单股RNA基因组。病毒基因组长约7.5 kb，包含三个主要开放阅读框（open reading frames, ORFs）。ORF1编码六种非结构蛋白，ORF2编码主要衣壳蛋白VP1，ORF3编码次要衣壳蛋白VP2，后者有助于病毒颗粒稳定性。在小鼠诺如病毒中，还鉴定出一个与VP1编码区重叠的替代ORF，即ORF4。基于VP1氨基酸序列，NV被分为10个基因组（GI–GX）和48种基因型，其中35种基因型可感染人类，分布于5个基因组：GI（9种基因型）、GII（23种基因型）以及GIV、GVIII和GIX（各1种基因型）。其中，NV GII.4导致大多数感染，且常与更严重的疾病相关。重要的是，重组VP1可自组装成病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs），在结构上类似于天然病毒粒子但缺乏病毒基因组材料，为基于VLP的NV疫苗开发提供了结构和安全性基础。NV通过组织血型抗原（histo-blood group antigens, HBGAs）附着于宿主细胞。阻断VLP与HBGA结合的抗体（HBGA阻断抗体）被广泛用作保护性免疫的功能替代指标。 NV VLPs已在多种平台中表达和纯化，包括大肠杆菌（Escherichia coli）、毕赤酵母（Pichia pastoris）、昆虫细胞和转基因植物。纯化的NV VLPs已被证明在小鼠口服给药后具有免疫原性，即使在缺乏黏膜佐剂的情况下也是如此。此外，在转基因马铃薯中表达的NV VLPs在小鼠和健康人类志愿者中均诱导了免疫应答。更广泛地说，植物生产的疫苗平台已被提出将抗原生产与口服递送相结合，可能减少对广泛纯化、冷链分销和无菌给药的需求。 此前，代表日本广泛流行的九种基因型（GI.2、GI.3、GI.4、GI.6、GII.2、GII.3、GII.4、GII.6和GII.17）的NV VLPs已成功使用家蚕-杆状病毒表达载体系统（silkworm-baculovirus expression vector system, silkworm-BEVS）表达和纯化。使用该系统生产的NV GII.4 VLPs经腹腔给药已被证明可诱导中和抗体。Silkworm-BEVS能够高效表达在其他表达系统中难以生产的重组蛋白，实现更高的溶解性和表达水平，约为常规昆虫细胞系统的10–100倍。由于每只家蚕作为独立的生物反应器，规模化生产主要通过增加家蚕数量来实现，而非扩大细胞培养生物反应器。因此，该平台非常适合多种重组蛋白的可规模化生产，支持其商业应用潜力。然而，尚未明确未纯化的VP1表达家蚕蛹制剂口服给药后是否能诱导全身和黏膜免疫应答，包括具有功能活性的抗体。 在本研究中，研究人员评估了口服给予VP1表达家蚕蛹制剂在小鼠中的免疫原性，比较了灌胃蛹悬浮液与自由摄食整只冻干蛹两种方式，并评估了诱导抗体的功能活性。

研究背景与问题

诺如病毒（Norovirus, NV）是全球急性胃肠炎的主要病原体，大多数个体一生中预计经历3–8次感染，且至少一次发生在5岁之前。幼儿和老年人尤其易患严重疾病。全球范围内，NV感染每年导致约20万人死亡，其中低收入和中等收入国家儿童死亡人数超过7万人。除沉重的健康负担外，NV感染相关的直接医疗费用估计每年达42亿美元，社会总成本约达603亿美元。然而，目前尚无获许可的NV疫苗。NV属于杯状病毒科（Caliciviridae），为直径约40 nm的无包膜病毒，具有正链单股RNA基因组。病毒基因组包含三个主要开放阅读框（open reading frames, ORFs），其中ORF2编码主要衣壳蛋白VP1。重组VP1可自组装成病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs），为基于VLP的NV疫苗开发提供了结构基础。NV通过组织血型抗原（histo-blood group antigens, HBGAs）附着于宿主细胞，阻断VLP与HBGA结合的抗体被广泛用作保护性免疫的功能替代指标。

NV VLPs已在多种平台中表达和纯化，包括大肠杆菌、毕赤酵母、昆虫细胞和转基因植物。纯化的NV VLPs口服给药后在小鼠中具有免疫原性，转基因马铃薯表达的VP1也能在小鼠和健康人类志愿者中诱导免疫应答。此前，代表日本广泛流行的九种基因型的NV VLPs已成功使用家蚕-杆状病毒表达载体系统（silkworm-baculovirus expression vector system, silkworm-BEVS）表达和纯化，腹腔给药GII.4 VLPs可诱导中和抗体。Silkworm-BEVS可实现高效表达，每只家蚕作为独立生物反应器，适合可规模化生产。然而，尚未明确未纯化的VP1表达家蚕蛹制剂口服给药后是否能诱导全身和黏膜免疫应答，包括具有功能活性的抗体。因此，本研究旨在评估口服给予VP1表达家蚕蛹制剂在小鼠中的免疫原性。

研究内容与结论

研究人员使用家蚕蛹表达NV GII.42006b和GII.17的VP1蛋白，制备了蛹悬浮液和冻干整蛹两种制剂，通过灌胃和自由摄食两种方式免疫小鼠，评估了诱导的全身和黏膜免疫应答及其功能活性。结果表明，口服给予VP1表达家蚕蛹制剂可诱导全身血清IgG和黏膜肠道灌洗液（intestinal lavage fluid, ILF）IgA应答，灌胃后检测到HBGA阻断活性，自由摄食后检测到基于细胞的病毒中和活性。这些发现表明，口服未纯化的VP1表达家蚕蛹制剂可诱导具有功能活性的抗体。此外，GII.17 VP1表达蛹诱导的免疫应答表明该方法的免疫原性不限于GII.42006b抗原。

关键技术方法

本研究使用的主要技术方法包括：家蚕-杆状病毒表达载体系统（silkworm-BEVS）用于表达VP1抗原；酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）用于定量VP1含量和检测抗体应答；HBGA阻断试验用于评估抗体阻断VLP与HBGA结合的功能活性；基于人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell, iPSC）来源肠上皮细胞的诺如病毒中和试验用于评估中和抗体活性；实时定量PCR（quantitative PCR, qPCR）用于定量病毒基因组拷贝数。动物实验使用雌性BALB/c小鼠，病毒样本来源于日本大阪府急性胃肠炎患儿粪便样本。

研究结果

剂量依赖性免疫应答（灌胃）：小鼠在第0周和第2周各灌胃两次，每次含0.2–5.0 mg VP1的蛹悬浮液。抗原特异性抗体应答主要在高剂量组中观察到。血清IgG滴度从第2周起增加，1.7 mg和5.0 mg组高于PBS对照组。ILF中抗原特异性IgA应答在0.6、1.7和5.0 mg组中显著高于PBS对照组，其中1.7 mg组应答最高。血清HBGA阻断活性在1.7 mg和5.0 mg组中检测到。

给药频率和累积抗原剂量对抗体应答的影响（灌胃）：小鼠按不同给药周期方案接受含5.0 mg VP1的蛹悬浮液，一个周期包含连续四天每日给药，周期数从0到4不等。血清IgG滴度在所有免疫组中均被诱导，并随给药周期数增加至两个周期，之后尽管增加周期数也无进一步增加。ILF IgA应答和血清HBGA阻断滴度呈现相似模式，所有免疫组均显著高于Na?ve对照组，并在两个或更多周期后趋于平台期。

自由摄食GII.42006b VP1表达蛹诱导的免疫应答和中和活性：小鼠每周自由摄食2或5只冻干整蛹，持续三周。5只组中血清IgG、血清IgA、ILF IgG和ILF IgA应答均显著高于Na?ve对照组，而2只组与Na?ve对照组无显著差异。5只组的合并血清和ILF样本在基于人iPSC来源肠上皮细胞的NV GII.42006b中和试验中显示出中和活性。合并血清还显示出对异源GII.4 Sydney 2012变异株的交叉中和活性，抑制程度取决于输入病毒量。

自由摄食方法对另一种NV基因型的适用性：小鼠每周自由摄食5只GII.17 VP1表达蛹，持续三周。血清和ILF中的IgG和IgA应答均显著高于Na?ve对照组。相应的合并血清和ILF样本对NV GII.17显示出中和活性。这表明自由摄食方法可适用于第二种基因型，每种抗原均诱导对同型病毒的中和活性。

讨论与结论

研究人员此前已证明silkworm-BEVS表达的NV GII.42006b VP1可形成VLPs并在腹腔免疫后诱导中和抗体。本研究将该方法扩展到口服免疫，使用未纯化的VP1表达家蚕蛹制剂，包括蛹悬浮液和冻干整蛹。口服给药诱导了全身血清IgG和黏膜ILF IgA应答，灌胃后检测到HBGA阻断活性，自由摄食后检测到基于细胞的中和活性。灌胃和自由摄食模型应视为互补方法而非直接可比，两者在表达构建体、抗原制备、剂量确定性、摄食行为和暴露动力学方面存在差异。口服免疫诱导的抗体可抑制病毒复制，HBGA阻断抗体滴度与中和抗体水平及降低NV感染风险相关。抗体诱导受给药设计影响，包括抗原剂量、给药频率、间隔和累积暴露量。最高剂量下观察到的非单调IgA应答可能反映黏膜免疫的复杂调控，包括口服耐受。本研究存在一些局限性，包括使用PBS而非非VP1表达蛹悬浮液作为对照，以及未直接检验VP1在蛹制剂中的结构状态。自由摄食模型为可食用疫苗开发提供了实用形式，避免了束缚和重复给药相关应激。Silkworm-BEVS的高生产力和可规模化性可能为口服疫苗开发提供优势，特别是需要高抗原输入的情况下。本研究作为概念验证，表明未纯化的NV VP1表达家蚕蛹制剂可诱导全身和黏膜免疫应答，并产生具有HBGA阻断和基于细胞中和活性的抗体，为优化silkworm-BEVS来源的VP1表达蛹制剂作为口服递送NV疫苗候选物的实用平台提供了基础。