头颈癌患者血浆小细胞外囊泡诱导T细胞功能失调表型的研究

《British Journal of Cancer》：Small extracellular vesicles from the plasma of head and neck cancer patients induce dysfunctional T cell phenotypes

　　

背景：头颈癌（head and neck cancer, HNC）具有高度免疫抑制性。尽管免疫检查点（immune checkpoint, IC）抑制剂取得了进展，但许多HNC患者未能产生应答。肿瘤来源的小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs）可能通过改变T细胞表型促进免疫逃逸和治疗抵抗。 方法：研究人员通过尺寸排阻色谱法从HNC患者样本和对照组中分离血浆sEVs。对血浆sEVs进行表征，并分析其对CD4+和CD8+ T细胞功能、IC水平和基因表达的影响。 结果：HNC患者来源的sEVs抑制CD4+和CD8+ T细胞功能，并促进CD8+ T细胞凋亡，且与疾病进展相关。血浆sEVs可增强ATP向AMP的转化，并调节外切核苷酸酶的表达。IC谱分析显示复杂变化：CD4+ T细胞上TIGIT和CTLA-4表达升高，而BTLA、PD-1和LAG-3表达降低；CD8+ T细胞则表现出抑制性和刺激性IC的整体下调。PD-1阻断不能完全阻止sEV介导的T细胞抑制。 结论：研究结果表明，血浆sEVs通过诱导T细胞功能失调表型参与HNC的系统性免疫调节。血浆来源sEVs调节T细胞上IC表达的能力强调了进一步探究其在HNC免疫治疗策略中相关性的必要性。

研究背景

头颈癌（head and neck cancer, HNC）是全球最常见的十大癌症之一，常在晚期才被确诊，导致许多患者的治疗效果和预后不佳。HNC的一个主要特征是其高度免疫抑制的肿瘤微环境，表现为抑制性免疫检查点分子如PD-1/PD-L1和CTLA-4的表达，这些分子会削弱抗肿瘤T细胞反应。虽然靶向PD-1和CTLA-4的免疫检查点抑制剂（immune checkpoint inhibitor, ICI）改善了一些患者的预后，但仍有大量患者无法产生应答，这表明除了经典的检查点通路之外，还存在其他免疫调控机制。

肿瘤释放多种抑制免疫细胞功能的因子，包括肿瘤来源的小细胞外囊泡（tumour-derived small extracellular vesicles, TEVs）。已有研究发现，来自HNC的TEVs能够抑制T细胞和B细胞的功能、降低自然杀伤（natural killer, NK）细胞的细胞毒性、促进巨噬细胞的促炎表型以及改变树突状细胞的抗原加工过程。HNC患者血浆和唾液中的小细胞外囊泡（small extracellular vesicles, sEVs）会促进免疫抑制，同时血浆sEVs还能以分期依赖的方式增强血管生成。

为了更深入地理解血浆sEVs在免疫逃逸和癌症进展中的作用，有必要研究这些囊泡如何改变受体免疫细胞的功能。既往研究表明，与健康供体相比，HNC患者血浆sEVs含有更高水平的免疫抑制分子，并能显著损害T细胞功能。携带PD-L1和PD-L2的TEVs可直接抑制T细胞活性，促进肿瘤免疫逃逸，并介导对ICI的耐药性。此外，腺苷能通路是TEVs发挥免疫抑制效应的重要机制，该通路由外切核苷酸酶CD39和CD73介导，产生的腺苷营造了有利于肿瘤进展的免疫抑制微环境。近期发现还提示，TEVs不仅通过内吞作用，还可通过直接接触影响免疫细胞功能，使得即使在去除sEVs后也能更有效地修饰多种免疫细胞。

本研究旨在探讨HNC患者血浆sEVs在免疫调节中的作用，通过检测这些囊泡如何改变受体免疫细胞功能和基因表达，探索sEVs与ICI之间的相互作用，以期更好地理解sEV介导的免疫调控及其在HNC肿瘤免疫逃逸和生物标志物开发中的潜在意义。

主要关键技术方法

研究人员从德国曼海姆大学医院耳鼻咽喉头颈外科收集了50例HNC患者、20例无疾病证据（no evident disease, NED）患者和22例健康供体（healthy donor, HD）的血浆样本。采用尺寸排阻色谱法（size-exclusion chromatography, SEC）分离血浆sEVs。通过透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）和纳米颗粒追踪分析（nanoparticle tracking analysis, NTA）对sEVs进行物理表征，并通过蛋白质印迹法（western blot）分析蛋白标志物。利用共聚焦显微镜观察sEVs与T细胞的相互作用。通过流式细胞术检测CD69活化标记物、CFSE增殖实验、ELISA检测TNF-α和IFN-γ、Annexin V凋亡分析评估T细胞功能。采用高效液相色谱荧光检测法（HPLC-FL）分析ATP代谢。使用多色流式细胞术检测免疫检查点受体表达。利用NanoString nCounter技术进行基因表达分析。

研究结果

临床病理学特征

纳入的50例HNC患者以男性为主，中位年龄64岁，多为晚期（UICC III/IV期占68%），常见于口咽部（46%），人乳头瘤病毒（human papillomavirus, HPV）感染率为41%。

血浆sEVs的表征及其与T细胞的相互作用

分离的血浆sEVs呈现典型球形形态，直径约100 nm。HNC、NED和HD三组间sEVs的颗粒浓度和总蛋白含量无显著差异。蛋白质印迹证实sEVs富含CD63、CD81和TSG101等囊泡相关蛋白，而细胞蛋白Grp94未检出。共聚焦显微镜显示，荧光标记的sEVs可被活化的CD4⁺和CD8⁺ T细胞内化。

血浆sEVs抑制T细胞功能

HNC来源的sEVs使CD4⁺ T细胞早期活化标志物CD69表达略有下降。CFSE增殖实验表明，HNC sEVs显著抑制CD4⁺ T细胞增殖，而HD或NED的sEVs几乎没有抑制作用，且晚期HNC患者的抑制趋势更强。抗PD-1抗体预处理可减轻但不能完全逆转这种抑制。HNC sEVs使CD4⁺ T细胞的TNF-α产生减少，但对IFN-γ无显著影响。在腺苷代谢方面，晚期HNC sEVs增强了CD4⁺ T细胞将ATP转化为ADP和AMP的能力，但对AMP向腺苷的转化无影响。流式细胞术显示CD39表达略有升高趋势，CD73表达无变化。对于CD8⁺ T细胞，HNC sEVs显著诱导Jurkat细胞凋亡，抗PD-1抗体可减轻但未完全阻止该效应。HNC sEVs还显著抑制原代CD8⁺ T细胞的增殖和TNF-α产生，而IFN-γ呈诱导趋势。

血浆sEVs影响T细胞上免疫检查点受体的丰度

多色流式细胞术分析显示，HNC sEVs处理后的CD4⁺ T细胞表面免疫刺激性CD137以及免疫抑制性TIGIT和CTLA-4表达上调，而抑制性PD-1、LAG-3、TIM-3和BTLA表达下调。相比之下，HNC sEVs处理后的CD8⁺ T细胞主要表现为除TIGIT外的所有检测免疫检查点的整体下调，其中CD137、OX40、BTLA、PD-1和LAG-3显著降低。值得注意的是，HD sEVs也引起部分类似变化，提示这些效应并非严格疾病特异性。

血浆sEVs改变T细胞基因表达

NanoString基因表达分析显示，HNC sEVs处理后，CD4⁺ T细胞中免疫抑制基因SIGIRR和CTLA4的mRNA水平中度上调，同时免疫激活基因CD58和EP300也上调，而TNFSF11和IL6下调。在CD8⁺ T细胞中，HNC sEVs诱导免疫刺激基因IRF5、PTPRC和PRKCE上调，RUNX1下调，并促进了PD-1配体PDCD1LG2（PD-L2）的表达。抗PD-1预处理后，CD4⁺ T细胞中CD27、TNFRSF1B和BCL2L1上调；CD8⁺ T细胞中ADORA2A上调，BTLA和CASP3下调。

讨论与结论总结

讨论部分指出，研究成功富集了具有典型sEV特征的血浆囊泡，并证实它们能被T细胞内化并发挥免疫抑制功能，尤其在晚期疾病中更为显著。HNC sEVs抑制了CD4⁺和CD8⁺ T细胞的增殖、活化和TNF-α产生，并诱导CD8⁺ T细胞凋亡，这与先前研究一致。在腺苷代谢方面，sEVs增强了ATP向ADP/AMP的转化，但完全转化为腺苷可能需要更高浓度的TEVs存在于肿瘤微环境中。免疫检查点表达分析揭示了复杂的调控模式：CD4⁺ T细胞上TIGIT、CTLA-4和CD137上调，而PD-1、LAG-3和BTLA下调，这可能反映了调节性或抑制性CD4⁺亚群的特征；CD8⁺ T细胞则表现为抑制性和刺激性IC的整体下调，提示sEVs促进的是T细胞失活而非典型的耗竭表型。基因表达分析虽为探索性结果，但支持了上述蛋白层面的发现。重要的是，抗PD-1 ICI预处理能部分减轻sEV介导的抑制作用，但无法完全阻止，表明sEVs可能靶向了PD-1/PD-L1以外的其他通路，提示联合靶向CTLA-4、LAG-3或TIGIT的治疗策略可能更有前景。

研究结论：本研究发现血浆sEVs通过诱导T细胞功能失调表型参与HNC的系统性免疫调节。血浆来源sEVs调节T细胞上免疫检查点表达的能力强调了进一步探究其在HNC免疫治疗策略中相关性的必要性。