镁通过抑制MCU介导的线粒体钙超载增强巨噬细胞对牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）的免疫清除

《Cell Proliferation》：Magnesium Enhances Immune Clearance of P. gingivalis in Macrophages by Suppressing MCU-Mediated Mitochondrial Calcium Overload

　　

牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）是牙周炎中的关键牙周病原体，以其逃避宿主免疫清除的能力而著称。其胞内生存导致局部和全身感染，从而增加牙周炎及其相关全身性疾病的风险。然而，巨噬细胞清除P. gingivalis的能力有限，这有助于疾病的发生和发展。研究人员的研究结果证实，P. gingivalis存在于牙周炎组织中，且胞内P. gingivalis主要定位于巨噬细胞。然而，P. gingivalis不能被巨噬细胞完全清除，并通过受损的牙周组织进入血液循环，导致全身感染。转录组分析确定线粒体钙单向转运体（MCU）为与巨噬细胞中P. gingivalis免疫逃逸相关的潜在关键分子。体外功能分析进一步证实，P. gingivalis感染增加MCU表达，并导致胞质和线粒体钙超载，从而损害巨噬细胞对胞内P. gingivalis的清除。值得注意的是，镁作为天然钙拮抗剂，可抑制MCU通路，逆转钙超载，并增强巨噬细胞介导的P. gingivalis清除。局部给予含镁的海藻酸甲基丙烯酰（AlgMA）水凝胶可显著减少局部和全身P. gingivalis感染，缓解炎症，并减轻牙周组织破坏。总之，研究人员的研究结果确定MCU介导的钙超载是P. gingivalis逃避巨噬细胞免疫清除的一种此前未被认识的机制。此外，镁介导的Ca²⁺稳态恢复为牙周炎和其他感染性疾病提供了一种有前景的宿主导向免疫调节疗法。

镁通过抑制MCU介导的线粒体钙超载增强巨噬细胞免疫清除牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）的机制研究

牙周炎是常见的慢性炎症性疾病，以牙周支持组织逐渐破坏为特征，可导致成人牙齿丧失，并与心血管疾病、呼吸系统疾病、阿尔茨海默病、肠道疾病及癌症等全身性疾病相关。牙龈卟啉单胞菌（P. gingivalis）是牙周炎的主要病原体，其凭借逃避宿主免疫清除的能力，驱动局部和全身感染。巨噬细胞和中性粒细胞是先天免疫系统中吞噬和清除P. gingivalis的关键细胞，但P. gingivalis可通过多种策略（如调控补体系统和Toll样受体2信号通路）逃避清除，在细胞内持续生存。钙离子作为细胞内第二信使，在吞噬、吞噬体成熟和胞内杀菌中发挥重要作用。线粒体钙单向转运体（mitochondrial calcium uniporter，MCU）是线粒体基质摄取Ca²⁺的主要通道，其功能障碍可损害线粒体功能并加重巨噬细胞炎症反应。然而，P. gingivalis是否通过调控MCU影响钙水平进而促进自身生存和扩散尚不清楚。镁离子作为天然钙拮抗剂，可调节胞内钙水平并调节免疫细胞功能，是宿主导向免疫调节治疗的潜在候选。本研究旨在阐明P. gingivalis逃避巨噬细胞免疫清除的机制，并评估镁的治疗潜力。

研究人员建立大鼠牙周炎模型（丝线结扎第二磨牙并注射P. gingivalis 8周），通过显微计算机断层扫描（micro-CT）、组织学染色和免疫荧光等证实牙周组织破坏和炎症，并检测到P. gingivalis相关信号在牙周组织和心、肺、脑、结肠等远处器官中增加，表明P. gingivalis无法被完全清除并进入血液循环引起全身感染。免疫荧光共定位显示P. gingivalis主要被巨噬细胞（CD68阳性）吞噬，而非中性粒细胞。转录组分析显示P. gingivalis感染巨噬细胞后出现广泛基因表达变化，MCU显著上调。体外实验证实P. gingivalis感染上调MCU表达，导致胞质和线粒体钙超载；使用MCU抑制剂MCU-i4可减少胞内P. gingivalis数量且不影响吞噬能力，提示MCU介导的钙超载损害了巨噬细胞胞内清除功能。镁处理（5 mM Mg²⁺）可抑制MCU表达、逆转钙超载，并增强巨噬细胞对P. gingivalis的清除，且镁不直接抑制细菌生长。体内实验中，局部注射载镁藻酸甲基丙烯酰（AlgMA-Mg²⁺）水凝胶可持续释放Mg²⁺，显著减少局部和全身P. gingivalis感染，减轻炎症和牙周组织破坏。

本研究使用的主要技术方法包括：使用大鼠牙周炎模型（采用雄性SD大鼠，丝线结扎双侧上颌第二磨牙并隔日注射P. gingivalis ATCC 33277，持续8周）；通过免疫荧光共定位分析P. gingivalis与巨噬细胞（CD68）和中性粒细胞（MPO）的关系；利用转录组测序和生物信息学分析（DESeq2鉴定差异表达基因，GO和GSEA富集分析）筛选MCU；使用Fluo-4 AM和Rhod-2荧光探针分别检测胞质和线粒体Ca²⁺水平，并用MCU抑制剂MCU-i4和不同浓度MgCl₂处理THP-1来源巨噬细胞；通过qRT-PCR、ELISA、透射电镜和中性红摄取实验评估基因表达、炎症因子、胞内细菌和吞噬功能；体内给予AlgMA-Mg²⁺水凝胶（含7.5 mM Mg²⁺，405 nm光照交联）局部注射，通过micro-CT、H&E、Masson染色和免疫荧光评估治疗效果。样本来源包括THP-1细胞系和SD大鼠。

2.1 牙周炎以P. gingivalis局部感染和全身扩散为特征

通过结扎和P. gingivalis注射成功构建大鼠牙周炎模型，micro-CT显示釉牙骨质界（cementoenamel junction，CEJ）到牙槽嵴顶（alveolar bone crest，ABC）距离增加、骨体积分数（bone volume/total volume，BV/TV）降低、骨小梁分离度增加；H&E和Masson染色显示牙周膜纤维破坏和炎症细胞浸润；qRT-PCR显示促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α表达升高。免疫荧光显示牙周组织中P. gingivalis相关信号增加，且在心、肺、脑、结肠中也升高，表明P. gingivalis无法被完全清除并播散至全身。

2.2 P. gingivalis被巨噬细胞吞噬并触发炎症激活伴MCU上调

免疫荧光共定位显示P. gingivalis与巨噬细胞标志物CD68高度共定位，而与中性粒细胞标志物MPO无明显共定位，表明巨噬细胞是吞噬P. gingivalis的主要细胞类型。转录组分析显示P. gingivalis感染导致1173个基因上调和817个基因下调，GO和GSEA显示炎症和免疫应答通路富集；qRT-PCR和ELISA确认促炎细胞因子升高。差异表达基因分析显示MCU在感染巨噬细胞中上调，且体内牙周组织中巨噬细胞的MCU表达也升高。

2.3 P. gingivalis感染通过上调MCU表达诱发钙超载并促进胞内生存

使用Fluo-4 AM和Rhod-2检测，P. gingivalis感染巨噬细胞的胞质和线粒体Ca²⁺水平均显著升高，动态监测显示在30分钟达峰。MCU抑制剂MCU-i4可降低MCU表达并减少胞内P. gingivalis数量，但不影响巨噬细胞吞噬能力（中性红摄取试验），表明MCU介导的钙超载损害的是胞内清除而非吞噬。

2.4 镁通过抑制MCU通路和逆转钙超载增强巨噬细胞对P. gingivalis的清除

转录组和比色法显示P. gingivalis感染下调镁转运体CNNM1/2/3并降低胞内Mg²⁺浓度。外源补充MgCl₂（1、3、5 mM）中，5 mM可显著抑制MCU表达并逆转胞质和线粒体钙超载。镁不直接抑制P. gingivalis生长（OD600监测），但免疫荧光和透射电镜显示5 mM Mg²⁺显著减少巨噬细胞胞内P. gingivalis数量，表明镁通过恢复宿主免疫清除而非直接杀菌作用发挥作用。

2.5 镁有效抑制局部和全身P. gingivalis感染并减轻牙周炎大鼠炎症反应

体内给予AlgMA-Mg²⁺水凝胶（含7.5 mM Mg²⁺，可持续释放至35天）后，局部牙龈组织和心、肺、脑、结肠中的P. gingivalis相关信号均显著降低；H&E和Masson染色显示炎症细胞浸润和牙周组织破坏减轻，IL-6、IL-1β、TNF-α表达下降，牙周膜纤维排列趋于规则成熟。

讨论部分总结：本研究首次揭示MCU介导的钙超载是P. gingivalis逃避巨噬细胞清除的未识别机制。P. gingivalis通过上调MCU导致胞质和线粒体Ca²⁺超载，损害胞内清除能力，从而造成局部和全身感染。镁作为天然钙拮抗剂，通过抑制MCU、恢复Ca²⁺稳态增强巨噬细胞清除功能，且具有良好生物相容性和临床安全性，优于药理学MCU抑制剂。此外，镁还可能通过调节线粒体功能、炎症信号和巨噬细胞极化等途径发挥作用。AlgMA水凝胶作为载体实现镁的持续释放，减少局部和全身感染并促进组织修复。局限性包括P. gingivalis毒力因子如何调控MCU尚不清楚，镁的下游机制也需进一步研究。

研究结论：本研究确定巨噬细胞中MCU介导的钙超载是P. gingivalis免疫逃逸的一种新机制。镁可逆转P. gingivalis诱导的钙超载，促进巨噬细胞介导的局部和全身P. gingivalis清除，并减轻牙周炎中的炎症和组织破坏。该工作加深了对牙周病发病机制的理解，并为开发针对牙周炎及其相关全身疾病的宿主导向免疫调节疗法提供了实用见解。