《FASEB BioAdvances》：A Simple Temperature-Controlled Method for Preserving Viability in Human Pluripotent Stem Cell-Derived Retinal Organoids During Shipment
编辑推荐：
摘要翻译：
由人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）来源的视网膜类器官（retinal organoids, ROs）作为推动人类视网膜发育与疾病理解以及治疗策略开发的重要工具具有显著前景
摘要翻译：
由人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）来源的视网膜类器官（retinal organoids, ROs）作为推动人类视网膜发育与疾病理解以及治疗策略开发的重要工具具有显著前景。然而，利用hiPSC来源视网膜类器官模型的研究长期受到物流挑战的制约。一个突出问题在于科研协作需求的日益增长，因为涉及多机构协调的实验常常依赖活体组织的运输。在没有充分温度调控的条件下长途运输视网膜类器官可导致组织退化，进而干扰组织病理学分析并影响药物筛选 assay 的结果。视网膜类器官最常以无温度调节方式运输，或使用依赖锂离子电池供电的环境维持系统进行运输，而此类系统受到标准运输公司的严格管制，从而推高成本并引入进一步的物流复杂性。在本研究中，研究人员开发并评估了一种直接、经济且可靠的温控运输技术用于视网膜类器官运输，该技术可在寒冷月份维持适当的运输温度，并在全年运输过程中降低温度波动，从而保持类器官组织结构与活力。
论文解读文章
研究背景与问题
视网膜是精巧而复杂的神经结构，负责光检测与处理，作为中枢神经系统的延伸，人类视网膜缺乏再生能力，因此神经元损伤常导致不可逆视力丧失。人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的视网膜类器官（RO）可在体外三维培养中模拟天然视网膜的细胞组成与组织架构，并达到一定程度的功能成熟，成为视网膜疾病建模、药物筛选和移植治疗研发的重要平台。然而，多机构协作常需长途运输活体RO，运输过程中的温度波动或极端温度会导致组织退化，影响后续组织病理学分析与药物检测结果。常规泡沫箱运输虽便捷廉价，但无法稳定维持温度，尤其在冬季航空货舱或运输车辆中；而市售温控系统虽可维持恒温，但依赖锂离子电池，受到航空运输法规限制，且成本高昂、物流复杂。为此，研究人员开发并评估了一种简易、经济、可靠的温控运输系统——“Your Organoid Temperature Incubator”（YOTI），旨在寒冷月份维持适宜温度并全年降低温度波动，从而保护RO组织结构与细胞活力。
研究内容与结论
研究人员利用两种人iPSC系（A18945，女性脐带血来源；iLC42-3，男性尿液来源，科罗拉多大学产生）生成RO，并基于市售30盎司真空保温YETI Rambler Travel Mug设计YOTI系统，包含定制3D打印隔板、化学加热包（UniHeat 40+小时）及温度湿度探头。该系统总成本约140美元（不含3D打印机），开放访问的.stl文件已存放于GitHub。研究人员在?12°C冷冻室、4°C冰箱和室温（~22°C）三种环境条件下测试YOTI性能，结果显示YOTI可在低至0°C以下环境中维持25°C–37°C温度达20小时。随后，研究人员在一年内进行了20次从科罗拉多州奥罗拉至俄亥俄州阿克伦的FedEx标准隔夜运输，寒冷月份（12月至4月）使用化学加热包，温暖月份（5月、6月、8月、10月）则不用；同时设置“环境（ambient）”对照组（置于同一泡沫箱内但不在YOTI中）以及未运输对照组。结果显示，寒冷月份YOTI内部平均温度为30.5°C，显著高于环境温度15.6°C（p<0.001）；温暖月份平均温度虽无显著差异，但温度变异性存在显著差异（Kolmogorov–Smirnov检验，p<0.01）。对220天分化龄RO的组织学评估发现，YOTI运输RO的视网膜分层保留比例显著高于环境运输RO，且与未运输对照组无显著差异；TUNEL检测显示环境运输组细胞死亡显著增加，而YOTI组与对照组无显著差异。免疫荧光染色显示，无长突细胞（AP2α标记）和杆状双极细胞（PKCα标记）数量在各组间无显著差异；但环境运输组NRL阳性细胞数量显著低于对照组，YOTI组介于两者之间；视紫红质（rhodopsin）阳性细胞及NRL/rhodopsin双阳性细胞数量在环境运输组显著降低，YOTI组部分改善，与对照组和环境组均有显著差异。这些结果表明温度控制是维持RO光感受器标记物表达的重要因素，温度波动与极端温度可导致组织结构紊乱和细胞死亡。
关键技术方法
研究人员使用了两株人iPSC系（A18945和iLC42-3）诱导生成RO。核心方法为开发YOTI温控运输装置，即利用市售真空保温杯配合3D打印隔板、化学加热包和数据记录仪，实现被动式温度稳定。性能测试在冷冻室、冰箱和室温下进行，并通过FedEx标准隔夜运输进行全年实际物流验证。组织学评估采用DAPI核染色分析视网膜分层比例；细胞死亡用TUNEL检测；细胞组成用免疫荧光标记AP2α、PKCα、NRL和rhodopsin，并通过共聚焦显微镜定量。统计分析采用Brown-Forsythe ANOVA、Welch校正t检验及Kolmogorov–Smirnov检验。
研究结果分述
3.1 YOTI系统在受控与实际运输条件下的性能：在冷冻、冷藏及室温环境中，YOTI能将内部温度维持在25°C–37°C达20小时。实际运输中，寒冷月份YOTI平均温度为30.5°C，显著高于环境温度15.6°C（p<0.001）；温暖月份两者平均温度无显著差异，但温度变异性差异显著（p=0.001，Levene检验）。频率直方图及Kolmogorov–Smirnov检验进一步确认YOTI在冷、暖运输中均显著降低温度波动（p<0.01）。
3.2 YOTI运输后RO组织结构与活力评估：对220天分化龄RO的组织学分析显示，YOTI运输组与未运输对照组均保持典型的视网膜分层结构（外核层、外丛状层等），而环境运输组出现结构异常和层化减少。定量分析证实环境运输组的分层比例显著低于对照组和YOTI组（p<0.001）。TUNEL检测显示环境运输组TUNEL阳性细胞数显著高于对照组和YOTI组（p<0.05），表明YOTI运输可减少细胞死亡。
3.3 YOTI运输条件下细胞组成保存：免疫荧光定量显示AP2α和PKCα阳性面积在对照组、YOTI组和环境组间无显著差异。NRL阳性细胞数量在环境组显著低于对照组（p<0.001），YOTI组介于其间且与两者无显著差异。rhodopsin阳性细胞及NRL/rhodopsin双阳性细胞数量在环境组显著降低，YOTI组呈中间水平，与对照组（p<0.05）和环境组（p<0.01）均有显著差异，说明YOTI对成熟光感受器标记物有部分保护作用。
讨论与结论总结
讨论部分指出，传统泡沫箱运输在北美冬季可能导致RO冻损，而YOTI无需锂离子电池，不受航空运输管制，成本仅为约140美元，远低于Singh等人使用的Darwin Chambers培养箱（约860美元）。与Singh等（2022）使用锂电池培养箱运输早期RO的研究不同，本研究评估了成熟RO（220天）并对照未运输样本，更接近终末分化神经元对温度波动的敏感性。Georgiou等（2022）在温和季节运输较年轻RO并额外培养7天，未发现差异，而本研究在冬季运输、固定前不再培养，可能解释了结果差异。讨论还推测成熟光感受器（rhodopsin阳性细胞）比未成熟NRL单阳性细胞更易受温度波动损伤。研究局限包括未评估运输后电生理功能、未监测CO2/O2和pH变化、只涉及单一运输路线、RO数量较少且仅两个iPSC系和220天时间点。结论强调YOTI提供了一种简易、经济、可被任何航空公司接受的RO运输替代方法，在寒冷月份维持温度、全年降低温度波动，显著减少组织结构紊乱和细胞死亡，部分维持rhodopsin表达，有利于跨机构协作和可重复的类器官研究。
