《Oil Crop Science》：Simple and accurate quantification of diacylglycerols in vegetable oils by solid-phrase extraction chemical labelling coupled with UHPLC-MS/MS
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二酰甘油（Diacylglycerols, DAGs）是由三酰甘油经酶水解或在植物油中经脂肪酶催化形成的一类甘油酯，由两分子脂肪酸与一分子甘油缩合而成，包括sn-1,2(2,3)-DAG和sn-1,3-DAG两种异构体。传统植物油与新型DAG油脂中DAG含量分
二酰甘油（Diacylglycerols, DAGs）是由三酰甘油经酶水解或在植物油中经脂肪酶催化形成的一类甘油酯，由两分子脂肪酸与一分子甘油缩合而成，包括sn-1,2(2,3)-DAG和sn-1,3-DAG两种异构体。传统植物油与新型DAG油脂中DAG含量分别约为2%～10%（w/w）和40%～80%（w/w）。研究指出，SPE程序可在30分钟内完成且有机溶剂用量较少；所有分析物在温和条件下实现高效化学标记。研究人员开发了一种简便、快速且准确的方法，采用佛罗里硅土（Florisil）固相萃取吸附剂提取和纯化脂质样品中的DAG，并结合超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）进行定量分析。该方法已成功应用于复杂基质中DAG化合物的测定，并用于植物油中DAG成分与含量的分析，为植物油品质评价与营养功能研究提供了可靠的技术手段。
研究背景与问题：二酰甘油（DAG）是植物油中重要的甘油酯成分，其含量与异构体分布直接影响油脂的氧化稳定性及营养功能。目前常规液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）方法虽可检测DAG总量或特定类型，但受限于色谱分辨率不足和电离效率低，难以同时高通量、高灵敏地测定复杂油脂基质中多种DAG异构体。针对上述问题，本研究旨在建立一种简便、灵敏、准确的DAG定量方法，以满足植物油品质评价与营养研究的需要。
研究内容与结论：研究人员开发了一种固相萃取（SPE）结合化学标记预处理、超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）定量分析植物油中DAG的方法。以N,N-二甲基甘氨酸（DMG）为衍生化试剂，在1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺（EDC）和4-二甲氨基吡啶（DMAP）催化下对DAG进行化学标记，显著提高了质谱检测灵敏度。采用Florisil SPE柱对油脂样品进行净化和富集，优化了洗涤溶剂、洗脱溶剂及体积等关键参数。方法学验证表明，16种DAG化合物在相应线性范围内相关系数（R2）大于0.9865，检出限（LOD）为1～7 μg/kg，定量限（LOQ）为4～25 μg/kg；加标回收率为67.4%～106.1%，日内和日间精密度分别不超过11.8%和14.8%。将所建方法应用于花生油、大豆油、芝麻油、玉米油和橄榄油等实际样品测定，结果显示玉米油中DAG平均含量最高（27.58 mg/g），大豆油最低（10.28 mg/g），且不同油脂中DAG组成与含量存在明显差异。研究表明，该方法简便、准确、灵敏，能同时测定复杂脂质基质中16种DAG，为植物油中DAG谱分析与品质评价提供了有效工具，也为富含DAG功能性油脂的开发与质量控制提供了技术支撑。
关键技术方法：研究人员采用佛罗里硅土（Florisil）固相萃取柱对植物油样品进行预处理，以正己烷为稀释和洗涤溶剂、乙酸乙酯/正己烷（v/v, 3:7）为洗脱液，实现DAG的富集与基质干扰物的去除。随后以N,N-二甲基甘氨酸（DMG）为衍生化试剂，在EDC和DMAP催化下对DAG的羟基进行化学标记，生成叔胺标记产物，提升正离子模式下质谱响应强度。最终采用Shimadzu 8050三重四极杆串联质谱联用LC-30AD超高效液相色谱仪，配备Acquity Premier BEH C18柱（2.1×150 mm, 1.7 μm），在电喷雾离子源正离子多反应监测（MRM）模式下完成定性与定量分析。油样共5类30份，采集自当地超市，涵盖花生油、大豆油、芝麻油、玉米油和橄榄油各6份。
研究结果：
(1) 化学标记条件的优化：通过对比不同衍生化试剂，确定N,N-二甲基甘氨酸（DMG）可对所有目标DAG实现高效标记，具有最佳色谱响应峰面积；DMG用量为1.5 mg（即0.5 mL 30 mM DMG溶液）时标记效果最佳；反应温度为70 ℃时可获得最高的分析物峰面积；反应时间为90 min时各DAG化合物基本达到最高标记效率。
(2) SPE条件的优化：比较Florisil、HLB、Diol和Silica四种SPE吸附剂，Florisil获得最佳回收率（75.8%～107.3%），其他吸附剂回收率均低于50.7%；以正己烷为洗涤溶剂（8 mL）能高效去除甘油三酯、磷脂等非极性干扰物；采用乙酸乙酯/正己烷（v/v, 3:7）为洗脱液（8 mL）可获得最佳回收率。
(3) UHPLC-MS/MS参数优化：经DMG标记后，所有DAG化合物在正离子模式下均获得高丰度[M+H]+信号，并通过丢失103 Da的中性DMG片段生成保留完整二酰基结构的环状氧鎓离子产物离子；以含0.10%甲酸的异丙醇/乙腈（v/v, 9:1）为流动相B、含5 mmol/L乙酸铵的甲醇/水（v/v, 6:4）为流动相A时，各化合物获得最高质谱强度。
(4) 方法学验证：基质效应评价表明16种DAG的基质效应值为-19.1%～12.5%，说明SPE净化有效降低了基质干扰；在纯溶剂中构建校准曲线，R2均大于0.9865；LOD为1～7 μg/kg，LOQ为4～25 μg/kg；在50、100、200 μg/kg三个添加水平下，回收率为67.4%～106.1%，日内精密度不超过11.8%，日间精密度不超过14.8%。
(5) 实际样品应用：将建立的方法应用于30份植物油样品检测，结果显示DAG总平均含量依次为玉米油（27.58 mg/g）>橄榄油（22.09 mg/g）>芝麻油（20.42 mg/g）>花生油（14.72 mg/g）>大豆油（10.28 mg/g）。主要检出的DAG为1,3-DAG(18:2-18:2)、1,3-DAG(16:0-18:1)、1,3-DAG(18:1-18:1)和1,3-DAG(16:0-16:0)，而短链及单不饱和DAG（如1,2-DAG(8:0-8:0)、1,3-DAG(14:1-14:1)等）在各类样品中均未检出。
讨论与结论：本研究建立的SPE化学标记-UHPLC-MS/MS方法实现了植物油中16种DAG化合物的同时定量分析。与已有报道相比，该方法仅需16 mL有机溶剂，LOD低至1～7 μg/kg（比Wei等人报道的方法低近三个数量级），在灵敏度、溶剂消耗及操作简便性方面具有显著优势。该方法首次将Florisil SPE与化学标记结合应用于DAG分析，准确测定了5种植物油中DAG的含量与组成，证明了其在复杂基质中定量DAG的适用性。结论部分翻译：本研究成功开发了SPE化学标记结合UHPLC-MS/MS的新方法，用于油样中DAG的分离和纯化。Florisil SPE可高效提取DAG并去除脂质基质，步骤简便且有机溶剂用量少；DMG化学标记显著增强了分析物的离子强度并改善了UHPLC分离效果。方法学验证显示LOD为1～7 μg/kg，回收率为67.4%～106.1%，日内和日间精密度均低于14.8%。实际样品分析表明，花生油、大豆油、芝麻油和玉米油主要含有9种DAG化合物，浓度分布从痕量至较高水平。因此，该方法简便、准确、灵敏，可同时定量复杂脂质中16种DAG，有望广泛应用于植物油中DAG组成与分布分析。
