先天性巨结肠症（Hirschsprung disease）肠道神经元亚型特征：完全神经节段与移行区的比较研究

《Neurogastroenterology & Motility》：Subtypes of Enteric Neurons in Hirschsprung Disease: A Comparison of Fully Ganglionic and Transitional Zone

　　

专业术语翻译的论文摘要部分 背景：先天性巨结肠症（Hirschsprung disease, HD）的特征是远端肠道无神经节细胞症，以及邻近的移行区存在肠神经系统（enteric nervous system, ENS）结构异常。既往研究主要关注神经元密度，但尚不清楚移行区与完全神经节段肠道之间，肠道神经元的神经化学组成是否存在差异。因此，本研究旨在表征HD标本中这些区域的神经元亚型组成。 方法：分析了从儿科HD患者经拖出术（pullthrough surgery）切除的结肠标本。进行了显色免疫组织化学和多重荧光免疫组织化学（检测HuC/D、nNOS、ChAT），并在肌间神经丛和黏膜下神经丛中进行分析。数字图像分析（QuPath）实现了自动化细胞检测和亚型分类。细胞计数按每段长度进行标准化以用于密度分析。通过配对检验和互补的贝叶斯Dirichlet-多项回归模型分析神经元亚型组成。 主要结果：在移行区和完全神经节段肠道中均鉴定出HuC/D、nNOS和ChAT阳性的神经元，神经元密度仅有微小差异。对神经元亚型比例的配对分析和贝叶斯Dirichlet-多项模型表明，主要神经化学神经元亚型的相对组成在移行区和完全神经节段肠道之间基本保持不变。尽管在肠神经丛之间观察到了预期的亚型分布差异，但未发现一致的区域特异性改变。 结论与推论：在HD中，肠道神经元的神经化学亚型组成在移行区和完全神经节段肠道之间基本保持不变。在本研究的局限性内，未检测到移行区和完全神经节段肠道之间存在可解释持续性术后肠道功能障碍的重大神经元亚型组成差异。

论文解读文章

研究背景与问题

先天性巨结肠症（Hirschsprung disease, HD）是一种先天性疾病，其特征是远端肠道缺乏神经节细胞，导致严重的肠道功能障碍。虽然手术切除受累肠段是标准治疗方法，但许多患者在术后仍会经历长期的肠道问题。既往研究主要集中在形态学改变和神经元密度上，以界定移行区并指导手术切除。然而，对于移行区与手术后保留的完全神经节段肠道之间，肠道神经元的神经化学组成是否存在差异，以及这种差异是否与术后持续存在的症状有关，尚不明确。因此，研究人员开展了此项研究，旨在系统性地表征HD标本中移行区和完全神经节段肠道内，不同肠神经丛（enteric nervous system, ENS）中肠道神经元的神经化学编码及其亚型分布。

研究方法概述

研究人员从7例（5男2女）经组织学确诊的HD患儿在拖出术（pullthrough surgery）期间获取了结肠标本，年龄范围为3至54个月（中位年龄12个月）。主要采用了显色免疫组织化学和多重荧光免疫组织化学技术，针对泛神经元标志物HuC/D、神经元型一氧化氮合酶（neuronal nitric oxide synthase, nNOS）和胆碱乙酰转移酶（choline acetyltransferase, ChAT）进行标记。利用开源软件QuPath进行数字图像分析，实现自动化细胞检测和亚型分类。统计分析方面，使用了配对检验和贝叶斯Dirichlet-多项回归模型来处理数据的组成性质。

研究结果

3.1 神经元标志物的单一表达

通过显色免疫组织化学评估了HuC/D、nNOS和ChAT在肌间神经丛（myenteric plexus, MP）和黏膜下神经丛（外部ESP和内部ISP）中的表达。结果显示，HuC/D阳性细胞密度在完全神经节段的MP中显著高于移行区。而nNOS和ChAT阳性细胞的密度在两种区域之间无统计学显著差异。此外，血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide, VIP）和神经营养因子受体p75因在神经元、神经纤维和胶质细胞中广泛表达，未能进行定量分析。

3.2 多重荧光免疫组化揭示肠道神经元亚型

通过多重荧光免疫组化将神经元分为四类：HuC/D⁺/nNOS^?/ChAT^?、HuC/D⁺/nNOS⁺/ChAT^?（氮能）、HuC/D⁺/nNOS^?/ChAT⁺（胆碱能）以及HuC/D⁺/nNOS⁺/ChAT⁺（三阳性）。研究表明，各亚型在移行区和完全神经节段之间的密度差异均未达到统计学显著性。

3.3 神经元亚型在不同区域和神经丛的分布

通过汇总所有患者的神经元计数，计算了各亚型的相对比例。结果表明，大部分分析的肠道神经元为HuC/D⁺/nNOS^?/ChAT^?表型。总体而言，移行区和完全神经节段肠道之间的神经元亚型分布相似。进一步的患者水平配对比较也显示，在任何神经丛中，各亚型的比例在两种区域之间均无统计学显著差异。

3.4 神经元亚型组成的贝叶斯建模

为补充配对分析，研究人员采用了贝叶斯Dirichlet-多项模型。模型结果证实，神经元亚型组成的显著差异主要体现在不同的肠神经丛层之间（如MP与黏膜下神经丛），而非移行区与完全神经节段之间。区域效应和神经丛-区域交互作用的不确定性很大，其可信区间均跨越零值，表明没有证据支持移行区与完全神经节段肠道之间存在主要的神经元亚型组成变化。

讨论与结论

讨论部分总结：研究结果表明，尽管在肠神经丛之间存在预期的功能分化（如MP中氮能和三阳性神经元比例较高），但HD患者移行区和完全神经节段肠道的神经元亚型组成在很大程度上是相似的。这与先前认为术后功能障碍可能与神经化学亚型改变有关的假设不完全一致。讨论指出，研究中观察到的大量HuC/D⁺/nNOS^?/ChAT^?神经元可能代表了一个异质性群体，包括中间神经元、感觉神经元等表达其他标志物的细胞。同时，与既往健康对照人群数据的比较显示了比例上的差异，这可能是由于方法学（如自动分析与手动分析）、抗体、患者年龄和疾病状态的不同所致。研究还强调，HD中保留的完全神经节段肠道本身可能并非生理性正常，可能存在更细微的结构或功能异常。研究的局限性包括样本量较小、患者年龄和相关综合征的异质性、缺乏标准化的术后功能随访数据以及基于二维切片的量化方法。

结论部分翻译：综上所述，尽管观察到了预期的肠神经丛间差异，但神经元亚型组成在移行区和完全神经节段肠道之间基本保持不变。这些结果不支持由nNOS和ChAT定义的神经元亚型相对丰度的改变是导致持续性术后肠道功能障碍的主要原因。相反，未来的研究需要整合高维分子谱分析、功能性分析和三维成像，以确定神经元身份、连接性或回路组织中更细微的异常是否会导致手术治疗后持续的胃肠功能障碍。