海洋变暖与酸化揭示骨螺Hexaplex trunculus的转录可塑性

《Marine Environmental Research》：Ocean warming and acidification reveal transcriptional plasticity in the gastropod Hexaplex trunculus

　　

沿海生态系统，尤其是快速变暖的地中海，正日益受到由海洋变暖和酸化驱动的气候变化的影响。钙化海洋无脊椎动物尤其脆弱，但其分子响应仍知之甚少。本研究在模拟升温与降pH相结合的情景下，研究了具有生态和经济重要性的腹足类动物Hexaplex trunculus的基因表达动态。研究人员利用高通量RNA测序生成了足部转录组的从头组装（de novo assembly），随后进行差异基因表达分析，以表征在高排放（RCP 8.5）预测情景下，单一及交互胁迫因子引起的分子响应。足部组织——对运动、附着和环境交互至关重要——在与钙信号、离子转运、有氧呼吸、肌肉收缩和跨膜转运相关的基因中表现出显著的转录变化。海洋酸化成为转录变化的主导驱动因素，诱导代谢需求和离子调控通路发生大幅转变，这可能意味着能量成本增加和潜在的功能限制。研究结果表明，H. trunculus在复合气候胁迫因子下表现出显著的转录可塑性。通过为该物种提供基础转录组资源，并揭示其对预测环境变化的机制性响应，本研究增进了对地中海脆弱腹足类分子过程的理解，并为快速变暖海洋生态系统中的生态评估工作提供了信息。

论文解读

一、研究背景与科学问题

全球气候变化导致海洋持续变暖和酸化，已成为影响海洋生态系统最深刻的环境胁迫因子之一。过去50年间，海洋吸收了地球增温总量的90%以上，对海洋物种的生理、丰度、分布和营养关系产生了深远影响。与此同时，人类活动使大气二氧化碳浓度较前工业化时期增加了50%，其中约20%至30%被海洋吸收，导致海水pH下降，即海洋酸化（Ocean Acidification, OA）。海洋酸化还降低了海水中文石和方解石等碳酸钙矿物的饱和状态，对钙化生物——尤其是海洋腹足类——构成直接和间接威胁。

地中海是全球对气候变化最敏感的海域之一，其升温速率是全球其他海域的2至3倍。然而，在保护评估中，海洋无脊椎动物受气候变化影响的研究远不如鱼类和脊椎动物受到重视，尽管双壳类和腹足类等钙化物种对酸化极为脆弱。软体动物是地中海保护国际公约（如CITES、伯尔尼公约、巴塞罗那公约和欧盟栖息地指令）中代表性最广的类群，因此亟需加深对气候变化影响这些生物的科学认知。

骨螺（Hexaplex trunculus，Linnaeus, 1758）是一种广泛分布于地中海潮下带的腹足类，对过渡性沿海系统（如岩池、泻湖）中自然发生的温度和pH波动具有良好的适应能力。该物种已被广泛用作有机锡化合物（如三丁基锡，TBT）污染的生态指示生物，同时在多个国家（如意大利、突尼斯、葡萄牙和西班牙）具有重要的商业食用价值。此前研究已发现，低pH会降低H. trunculus贝壳的密度并增加孔隙度，同时增加个体觅食所需的时间和精力。然而，该物种在气候胁迫下的分子响应机制仍完全未知——此前尚无任何针对H. trunculus的从头转录组组装或RNA-seq研究发表，仅有一项针对TBT污染引发的性畸变（imposex）中维甲酸X受体（RXR）转录的靶向qPCR研究。

基于此，本研究旨在通过模拟RCP 8.5高排放情景下世纪末预期的环境条件（pH降低0.3个单位，温度升高3°C），开展为期14个月的慢性暴露实验，首次建立H. trunculus足部组织的从头转录组，系统解析其在海洋酸化、变暖及二者联合作用下的转录可塑性，填补该物种环境胁迫转录组数据的空白。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员从希腊克里特岛Elounda的浅水（<5m）软底栖息地采集H. trunculus个体，在实验室条件下以每10天降低0.05 pH单位、每10天升高0.6°C的速率逐步调整至目标条件，设置四个实验处理组：对照组（C，pH=8.1，环境温度）、酸化组（A，pH=7.8，环境温度）、升温组（W，pH=8.1，温度+3°C）和酸化升温联合组（AW，pH=7.8，温度+3°C）。实验持续14个月后，每组随机取4至5个个体，分离足部肌肉组织进行转录组分析。

主要技术方法包括：采用CTAB与NucleoZOL结合的RNA提取方法提取足部组织总RNA；通过Illumina双端测序获得转录组数据（每样本平均约4600万条读段）；使用Trinity v2.12.0进行从头转录组组装，获得765,481条转录本；利用BUSCO v5.8.0评估组装完整性（真核生物谱系数据集下完整性为75.3%）；通过BLASTN比对NCBI非冗余核苷酸数据库进行功能注释；使用DESeq2进行差异表达分析（显著阈值：p_adj < 0.05且|log2 fold change| > 5）；利用g:Profiler进行基因本体（Gene Ontology, GO）富集分析，并通过驱动GO术语（driver GO terms）两步过滤算法识别关键功能类别。

三、研究结果

3.1 RNA提取与测序

总RNA提取质量良好，平均92%的读段通过Q30质量阈值，平均GC含量为44%，Q30平均值为93%。由于软体动物28S rRNA存在隐藏断裂导致其与18S亚基共迁移，无法获得标准RIN值，但这不影响后续分析。

3.2 转录组组装

从头组装获得765,481条转录本。BUSCO分析显示，在255个真核生物通用单拷贝直系同源基因中，192个为完整（75.3%），41个为片段化（16.1%），22个缺失（8.6%），表明组装完整性良好。

3.3 差异表达分析

样本间相关性热图显示，同一处理组内的生物学重复形成紧密且独特的聚类（对角线相关性≈1.0），不同处理组间相似性较低，表明转录组差异源于生物学变异而非技术误差。对照组与升温组（W）之间相似性最高，而酸化组（A）与其他所有处理组之间的相似性最低。

基于差异表达基因（DEGs）的方差稳定变换主成分分析（VST-PCA）显示，酸化驱动的处理间分离极为显著（PERMANOVA: F=1214.1, R2=0.996, p<0.001）。酸化组（A）沿PC1（占总方差12%）表现出最大离散度，对照组（C）和升温组（W）在图中左上角紧密聚集，而酸化升温联合组（AW）沿PC2（占11%方差）位于左下区域。

与对照组相比，酸化组（A）有160个基因上调、205个下调；升温组（W）有142个上调、211个下调；酸化升温联合组（AW）有144个上调、189个下调。酸化组的上调转录本数量略高于其他两个处理组。

3.4 基因本体富集分析

热图分析鉴定出五个主要基因簇（c1–c5），各簇在不同处理间呈现独特表达模式。GO富集分析将基因簇与五大生物学过程（Biological Process, BP）关联：肌肉系统过程、生物调控与响应、细胞组分组织与生物发生、转运、代谢过程。

肌肉系统过程主要表达于簇1，该簇在酸化组（A）上调、在酸化升温联合组（AW）下调。生物调控与响应以及细胞组分组织与生物发生主要表达于簇2，该簇在升温组（W）下调。代谢过程相关转录本主要分布于簇1和簇2，在酸化组（A）上调、在升温组（W）下调。

小提琴图分析显示，各处理组的中位数均为正值（log fold change > 0），表明显著过表达。代谢过程类别在所有处理组间比较中均存在显著差异（A vs AW p=0.0058；A vs W p=7.8e^-07；AW vs W p=0.0089）。转运类别中，A与AW（p=0.032）及A与W（p=0.021）之间存在显著差异。

Upset图分析显示，与对照组相比，各处理组独有的下调转录本数量最多（A组153个、W组156个、AW组132个），三个处理组共有89个上调DEGs和10个下调DEGs。GO驱动术语分析表明，与ATP合成、线粒体过程、离子转运、磷酸化、呼吸、稳态、肌肉系统过程和生物合成过程相关的术语在酸化、升温或联合胁迫下受到强烈影响。与肌肉功能和钙活性相关的大多数GO术语在酸化组（A）和/或升温组（W）中上调。有氧呼吸在酸化组（A）和升温组（W、AW）中均上调。环核苷酸磷酸二酯酶（PDE）活性在酸化组（A）下调、在升温组（W）上调。

将A和W分别与AW比较时，Upset图显示A组有167个下调、51个上调独有转录本，W组有186个下调、30个上调独有转录本，A和W共有147个上调、20个下调DEGs。GO富集分析显示，有氧呼吸和细胞呼吸在A和W中均下调，质子跨膜转运在A中上调、在W中下调。所有与钙活性相关的GO术语在W与AW的比较中均显著上调。

四、讨论与结论

本研究发现，海洋酸化是驱动H. trunculus转录变化的主导因素，而单独升温仅引发较温和的热休克响应。酸化组（A）与对照组（C）的转录组差异最大，而升温组（W）与对照组（C）紧密聚集，表明升温单独作用的影响有限。值得注意的是，长期慢性酸化暴露下代谢基因呈现上调趋势，这与双壳类在急性短期酸化暴露中代谢基因通常下调以节约能量的模式不同——长期代谢抑制对生物体可能是致命的，代谢响应具有物种特异性和暴露时长依赖性。

钙相关GO术语在酸化组（A）中下调，表明长期酸化条件下腹足类的钙管理能力可能受损；而在升温组（W）中四个钙相关GO术语上调，提示升温可增强钙管理效率。在联合处理组（AW）中，两种胁迫因子的效应相互抵消，未观察到钙活性的显著上下调。钙离子不仅参与贝壳形成，还直接结合肌球蛋白调控组件以启动软体动物肌肉收缩，因此酸化对钙信号的影响可能同时损害贝壳矿化和肌肉功能。此外，PDE活性受Ca2?刺激且具有pH依赖性，酸性条件下因催化残基质子化导致活性下降，这与本研究中PDE在酸化组下调、在升温组上调的结果一致。

本研究首次建立了H. trunculus足部组织的从头转录组组装，提供了处理组特异的转录组图谱。研究发现酸化驱动肌肉系统过程、代谢需求和离子调控响应的主导性转变，这些足部特异的分子特征揭示了动态沿海栖息地中运动功能和感觉功能的潜在约束。研究强调，未来需结合外套膜和全组织RNA测序以更全面揭示贝壳形成相关分子特征，并建议开展多组织转录组分析以支持地中海保护策略和预测建模工作。

所有原始测序读段已提交至NCBI BioProject数据库，登录号为PRJNA1378232。