利用RNA荧光原位杂交技术在感染细胞的病毒工厂中同时检测神经坏死病毒的正义链RNA1和RNA2

《Journal of Virological Methods》：Simultaneous detection of positive-sense RNA1 and RNA2 of nervous necrosis virus in viral factories of infected brain cells using RNA-fluorescence in situ hybridization

　　

• •
  通过 RNA-FISH 同时检测 NNV 的 RNA1 和 RNA2
• •
  病毒 RNA 位于脑细胞的细胞质病毒工厂内
• •
  RNA 合成在空间上与重塑的线粒体相关
• •
  将 RNA-FISH 与免疫细胞化学结合，以绘制病毒 RNA 与翻译工厂的图谱。

引言

神经坏死病毒 (NNV) 是一种双部分正义 RNA 病毒，是研究这些过程的优良模型。RNA1 (3.1 kb) 编码基因组复制和转录所需的依赖 RNA 的 RNA 聚合酶 (RdRp)，而 RNA2 (1.4 kb) 编码病毒颗粒包装所需的外壳蛋白。此外，源自 RNA1 3'端的亚基因组 RNA3 (0.4 kb) 编码一种非结构病毒蛋白 B2，用于抑制宿主 RNA 干扰 (RNAi)。所有 NNV 病毒 RNA 在 5'端均含有帽子结构，但在 3'端没有多聚 (A) 尾 (Iwamoto et al., 2005)。病毒进入和脱壳后，NNV 的正义基因组 RNA (RNA1 和 RNA2) 被宿主翻译机制翻译，分别产生 RdRp 和外壳蛋白。新合成的 RdRp 随后定位到线粒体，在那里它利用正义基因组 RNA 作为模板进行负义 RNA 合成。在此过程中，RdRp 遇到一个 8 碱基配对螺旋，该螺旋作为转录的调控屏障。由于 RNA3 亚基因组位于正义 RNA1 的 3'端，当 RdRp 遇到该结构元件时会发生负义 RNA3 的合成。随后产生正义 RNA3 并作为 B2 蛋白合成的模板。RdRp 还可以克服结构屏障并继续进行全长负义 RNA1 的合成，随后作为正义 RNA1 及其编码的 RdRp 生产模板。NNV 各个 RNA 种类的相对丰度进一步通过产生 RNA3 同源和异源二聚体的模板切换机制进行调控，并有助于协调病毒 RNA 合成，导致 +RNA3 > +RNA1 = +RNA2 的复制效率。因此，RNA1、RNA2 和 RNA3 在病毒复制周期内经历连续的负义和正义 RNA 合成轮次。新合成的正义 RNA1 和 RNA2 随后被从 RNA2 翻译的外壳蛋白识别，使其能够被纳入子代病毒颗粒中。这种 NNV RNA 复制和转录的关系之前已有充分记载 (Cheng et al., 2025)。呼肠孤病毒的复制复合体组织已在甲类呼肠孤病毒中进行了相当详细的研究，特别是使用禽舍病毒复制复合体的冷冻电子断层扫描，揭示了病毒 RNA 复制隔室的膜相关架构 (Unchwaniwala et al., 2021)。在乙类呼肠孤病毒中，病毒蛋白 A (RdRp) 也被证明与线粒体结合，并含有线粒体定位靶向信号，为病毒复制机制的线粒体靶向提供了初步证据 (Guo et al., 2004)。

NNV 感染引起的病毒神经坏死病的特征是海洋鱼类幼体和稚鱼中枢神经系统的空泡化病变。这些病变已通过透射电子显微镜 (TEM) (Munday et al., 1992, Yoshikoshi and Inoue, 1990)、组织学检查 (Lai et al., 2001b) 和免疫检测 (Lai et al., 2001a) 得到充分记录。关于 NNV RNA 在感染细胞内的亚细胞分布，5-溴尿苷 (BrU) 掺入和免疫细胞化学实验显示蛋白 A (RdRp) 与 NNV 感染细胞内的位点病毒 RNA 合成共定位。此外，在感染细胞中也发现蛋白 A 与细胞内膜紧密结合，并与线粒体追踪剂 (Mito Tracker) 共定位 (Guo et al., 2004)。因此，推断线粒体是 NNV RNA 合成的复制工厂 (Guo et al., 2004)。在我们之前的研究中，我们提供了直接证据，显示线粒体追踪剂与新合成的 NNV RNA 共定位，以及使用 RNA 荧光原位杂交 (RNA-FISH) 和免疫细胞化学显示线粒体追踪剂与 NNV RNA1 和 RNA2 共定位 (Bajpai et al., 2025)。

原位杂交，特别是整体原位杂交，是分析发育模式生物如 果蝇 (Drosophila melanogaster) (Kosman et al., 2004) 和 斑马鱼 (Danio rerio) (Chen et al., 2002) 转录 mRNA 的关键技术。该技术依赖于互补核酸碱基配对，使用双链 DNA 或单链反义 RNA 探针来检测特定的 mRNA。尽管广泛用于比较细胞、组织或器官之间的转录本丰度，但这种整体原位杂交在分辨感染细胞内部亚细胞区域中的特定 RNA (如在内质网中复制的黄病毒病毒 RNA) (Zhang et al., 2019) 方面能力有限。

免疫细胞化学利用抗原特异性抗体使培养细胞中的特定蛋白及其亚细胞分布可视化。信号检测通常通过酶介导的显色反应（如碱性磷酸酶与 BCIP/NBT）或通过荧光显微镜下的荧光素偶联二抗进行荧光图像检测来实现 (Bajpai et al., 2025)。虽然免疫细胞化学为蛋白提供了精确的空间信息，但它并不能直接揭示病毒 RNA 的细胞内动态。

病毒 RNA 的细胞内组织和转运是 RNA 病毒生命周期的重要方面。对其他 RNA 病毒的研究表明，病毒 RNA 可以定位到特定的亚细胞区室并利用宿主细胞转运机制。在狂犬病毒感染的细胞中，内基小体已被鉴定为病毒转录和复制的位点 (Lahaye et al., 2009)。同样，对甲型流感病毒的研究表明，病毒 RNA 通过 Rab11 和微管依赖的途径转运，并且病毒 RNA 与 Rab11A 的共定位依赖于完整的微管纤维 (Amorim et al., 2011, Nturibi et al., 2017)。这些研究表明，病毒 RNA 的细胞内定位和移动与特定的细胞结构和转运途径密切相关。相比之下，乙类呼肠孤病毒中病毒 RNA 的空间组织和细胞内转运仍缺乏充分表征。尽管之前的研究描述了感染期间 NNV RNA 的细胞内分布和重新分布，但单个基因组 RNA 种类的空间组织及其与参与病毒复制、翻译和组装的不同亚细胞区室的关联仍未被完全理解。因此，链特异性 RNA 成像提供了一种进一步定义感染期间单个 NNV 基因组 RNA 空间组织的方法。

在此，我们描述了一种链特异性 RNA-FISH 方案，用于在感染的石斑鱼脑 (GB) 细胞中同时检测 NNV 的正义 RNA1 和 RNA2。在 RNA-FISH 之前，通过 Northern 印迹分析验证了探针特异性。为了将新合成的病毒 RNA 与传入的基因组 RNA 区分开来，在放线菌素 D 存在下进行了 BrU 标记。该方案与线粒体追踪剂染色以及针对病毒外壳蛋白或宿主因子（如识别 5'-帽子的磷酸化 eIF4E (p-eIF4E) 和参与翻译调控的重要核糖体蛋白 RPS6）的免疫细胞化学相结合，以确定病毒 RNA、线粒体和翻译相关区室之间的空间关系。这种方法为可视化感染期间 NNV RNA 的细胞内动态提供了一种稳健的方法，并可适用于其他 RNA 病毒。

章节摘要

细胞与病毒

GB 细胞于 2006 年建立自斑点石斑鱼 (Epinephelus coioides) 脑组织，本研究中使用了第 500 至 600 代的细胞 (Lin et al., 2006)。GB 细胞在 Leibovitz's L-15 培养基 (Gibco) 中培养，并补充 10% 胎牛血清 (FBS) (Gibco)、L-谷氨酰胺 (Gibco) 和青霉素 - 链霉素 (Gibco)，温度为 28 °C。龙胆石斑鱼 (GG) (Epinephelus lanceolatus) NNV (Chen et al., 2015) 分离自南方，属于红斑石斑鱼 (RG) NNV 基因型

感染期间 rGGNNV 在 GB 细胞中的 RNA 表达谱

Northern 印迹实验是为成功开发一种稳健方法（包括探针设计、制备和完整的杂交过程）以检测细胞内病毒 RNA 所做的准备工作。正义和负义病毒 RNA1 和 RNA3 的表达分别从感染后 3 (正义) 和 5 (负义) 小时开始明显观察到 (图 1A, B)，而 RNA2 的检测到更早，分别从感染后 1 (正义) 和 5 (负义) 小时开始 (图 1C, D)。随着

讨论

该方案建立了一种链特异性 RNA-FISH 方法，用于可视化 NNV RNA 的细胞内分布，并检查它们在感染细胞中与病毒和宿主成分的空间关系。决定该方法敏感性和链特异性的一个关键因素是探针设计。探针设计是链特异性 RNA-FISH 性能的关键决定因素，特别是对于产生重叠的基因组、反基因组和亚基因组 RNA 的 RNA 病毒。因为 3'-UTR

资助

本研究由中央研究院资助

CRediT 作者贡献声明

Vertika Bajpai: 写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿，可视化，验证，软件，方法学，调查，形式分析，数据整理，概念化。 Fu-En Liao: 可视化，验证，软件，方法学，调查，形式分析，数据整理。 Chia-Ching Chang: 监督，项目管理，调查。 Chang Chi Yao: 写作 – 审阅与编辑，写作 – 初稿，验证，监督，资源，调查，资助

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能会影响本文报告的工作。

致谢

我们感谢中央研究院 ICOB 影像核心设施提供的技术支持。

Vertika Bajpai|Fu-En Liao|I-Wen Lin|Ming-Hsien Chiang|Chen-Hung Li|Chien-Wen Chen|Shih-Chieh Chen|Yung-Song Wang|Chao-An Cheng|Chia-Ching Chang|Chi-Yao Chang