建立基于ORF2蛋白检测鹅astrovirus 1型抗体的间接竞争ELISA方法

《Journal of Virological Methods》：Establishment of an Indirect Competitive ELISA for Detection of Antibodies against Goose Astrovirus Genotype 1 Based on ORF2 Protein

1. 开发了一种竞争酶联免疫吸附测定法（ic-ELISA）用于检测GAstV特异性抗体。2. ic-ELISA检测方法具有敏感性、可靠性和可重复性。3. ic-ELISA检测方法可作为鹅产区GAstV-1诊断和血清学流行病学调查的工具。## 引言自2016年以来，中国主要鹅产区的小鹅中暴发了一种以痛风、出血和肾脏肿胀为特征的严重传染病，给家禽业造成了巨大的经济损失（Bi等，2024；Yang等，2018）。随后的分离、传播和基因组鉴定确定了病原体为一种新的鹅星状病毒（GAstV），该病毒是一种无包膜、正义单链RNA病毒，属于星状病毒科（*Astroviridae*），禽星状病毒属（*Avastrovirus*）（Pantin-Jackwood等，2006）。GAstV基因组长约7.1–7.3 kb，包含三个开放阅读框（ORF1a、ORF1b和ORF2），5′端非翻译区（UTR）、3′-UTR和多聚腺苷酸尾。ORF1a和ORF1b编码病毒转录和复制所必需的非结构蛋白（Wohlgemuth等，2019），而ORF2编码衣壳蛋白，对病毒装配、宿主细胞附着和免疫原性不可或缺（Arias和Dubois，2017）。系统发育分析将中国GAstV毒株分为两种不同的基因型，即GAstV-1和GAstV-2（Ren等，2025）。虽然两种基因型均可引起小鹅内脏痛风，但它们在流行率和地理分布方面存在显著差异。自2015年出现以来，GAstV-2一直是主要的流行毒株（He等，2022；Xiang等，2024）。相比之下，GAstV-1历史上流行率较低，但近期越来越多地报道其在多个省份循环传播，表明其流行病学意义正在逐渐上升（Chen等，2025；Wang等，2025；Wang等，2021；Wei等，2024）。鉴于GAstV的广泛流行和缺乏有效的商业疫苗，早期和准确的诊断对于实施及时干预、限制病毒传播和减轻疫情严重程度至关重要。迄今为止，已报道了多种GAstV分子检测方法，包括能够区分GAstV-1和GAstV-2的实时定量逆转录PCR（RT-qPCR）检测和重组酶聚合酶扩增（RT-RPA）检测等（Liu等，2025；Wang等，2022；Yi等，2022）。尽管这些分子技术具有较高的敏感性和特异性，但通常需要精密仪器、经过培训的人员和大量费用，这限制了它们在资源有限的现场环境中的广泛应用。相比之下，酶联免疫吸附测定法（ELISA），特别是竞争性格式，具有快速、经济且样本处理要求少的实际优势。间接竞争ELISA（ic-ELISA）基于血清抗体与标记的单克隆抗体竞争结合固定抗原的原理，能够精确量化复杂生物基质中的特异性抗体（Kohl和Ascoli，2017）。最近，已开发出使用重组衣壳蛋白作为包被抗原来检测GAstV-2抗体的间接ELISA（He等，2023）。然而，针对GAstV-1血清学监测的诊断方法开发较少，针对该基因型的高效血清学检测方法仍然缺乏。ORF2衣壳蛋白作为GAstV唯一的结构蛋白，由于其表面暴露位置、抗原稳定性和免疫优势，在开发诊断工具方面具有重要潜力。在本研究中，我们旨在利用重组ORF2蛋白和特异性靶向GAstV-1的单克隆抗体开发一种敏感、特异且可重复的ic-ELISA。利用现场血清样本系统评估了所建立检测方法的分析敏感性、特异性、可重复性和临床应用性。本研究开发的基于ORF2的ic-ELISA为鹅产区的GAstV-1感染大规模流行病学监测、早期预警和疫苗免疫后免疫监测提供了一种有前景的血清学工具。## 章节摘录### 毒株、抗血清和临床样本本研究使用的GAstV-1毒株（GenBank登录号：OR827024）是从江苏省小鹅内脏痛风临床疫情中分离获得的。其他禽类病毒——包括H9N2禽流感病毒（H9N2-AIV）、禽呼肠孤病毒（ARV）、鹅细小病毒（GPV）、鹅星状病毒2型（GAstV-2）和登布苏病毒（TMUV）——作为参考毒株保存。阴性血清样本由采集自未感染鹅的血液制备，血液自然凝固后离心。### 重组ORF2蛋白和单克隆抗体表征表达的ORF2蛋白在SDS-PAGE和Western blot上的分子量约为57 kDa，与包含His标签的预测融合蛋白一致（图1）。纯化的单克隆抗体（4E6）被鉴定为IgG1/κ，浓度为2.8 mg/mL，通过间接ELISA测得滴度为1:25600。免疫荧光测定（IFA）显示，单克隆抗体4E6特异性识别GAstV-1感染的GRTE细胞，显示明亮的胞质荧光，且不与未感染的细胞交叉反应。### 讨论在本研究中，我们成功开发并表征了一种靶向GAstV-1 ORF2衣壳蛋白的敏感、特异且可重复的ic-ELISA，弥补了这种新兴禽类病原体血清学监测工具方面的关键空白。鉴于GAstV-1日益增长的流行病学重要性和商业疫苗的缺乏，基于ORF2的ic-ELISA代表了分子诊断的一种实用且经济的替代方法，特别是在资源有限的现场环境中。### 作者贡献构思和设计实验：JY、FW、XD、JD。进行实验：JY、FW、XD、JD。分析数据：JY、FW。撰写论文：JY、FW。### 机构审查委员会声明本研究已获得山东农业大学动物护理和使用委员会的批准（批准号：# SDAUA-2022-199），并按照科技部（中国北京）的"实验动物指南"进行。### 知情同意声明不适用。### 利益冲突作者声明无利益冲突。### 资金山东农业工程学院高层次人才启动基金（BSQJ202328）；山东农业工程学院高层次人才启动基金（2025GCCZR-42）。### CRediT作者贡献声明**刁幼江：** 撰写——原稿，监督，软件，方法论，调查，概念化。**刁幼祥：** 监督，方法论，调查，概念化。**魏峰：** 撰写——审阅与编辑，撰写——原稿，监督，调查，获得资金，概念化。**杨静：** 撰写——审阅与编辑，撰写——原稿，调查，数据整理，概念化。### 竞争性利益声明作者声明，他们没有任何已知的竞争性经济利益或个人关系，这些可能会影响本论文所报告的工作。杨静|魏峰|刁幼祥|刁幼江