一种改良的 SDS-LiCl 方法，用于从富含黏液的秋葵组织中提取高质量 RNA 及下游病毒检测

《Journal of Virological Methods》：A modified SDS–LiCl method for high quality RNA isolation from mucilage rich okra Tissues and downstream virus detection

　　

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  改进的SDS–LiCl方案有效地从秋葵组织中去除黏液。
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  该方案从叶片、茎、花、果实和种子中获得了高质量的RNA。
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  改进的SDS–LiCl改善了TSV的RT-PCR/RT-qPCR检测，在RNA稀释度高达10??时仍能可靠检测，优于现有的提取方案。

引言

秋葵（Abelmoschus esculentus L.）是一种属于锦葵科的经济重要蔬菜作物，在印度次大陆广泛种植。印度是秋葵的主要生产国，贡献了全球约72.9%的产量，年产量为635万吨。印度主要的秋葵生产邦包括古吉拉特邦、西孟加拉邦、比哈尔邦、奥里萨邦、北方邦、安得拉邦和泰米尔纳德邦（农业与农民福利部，2021）。尽管具有重要的经济价值，秋葵的生产力受到多种生物和非生物胁迫的严重影响（Mishra等人，2017）。在主要的生物约束因素中，由单分体番茄斑驳病毒引起的黄脉花叶病（YVMD）和秋葵异型叶卷曲病（OELCuD）被认为是极具破坏性的，导致严重的产量损失（Jamir等人，2020，Mubeen等人，2021，Venkataravanappa等人，2015，Venkataravanappa等人，2012）。除了番茄斑驳病毒外，烟草条纹病毒（Ilarvirus TSV）（TSV），属于Ilarvirus属，已成为感染秋葵的重要病毒病原体，与果实畸形花叶病相关。TSV感染会引起褪绿斑点、叶片褪绿斑块、叶片畸形、褪绿条纹和果实畸形等症状，导致高达63%的产量损失（Krishnareddy等人，2003）。TSV主要通过蓟马传播，据报道，多个蓟马物种是不同栽培体系中该病毒的传播媒介（Prasada Rao等人，2003，Sharman等人，2015）。除媒介传播外，种子传播TSV已在多种寄主植物中被记录，表明感染种子可能有助于病毒的传播和后续作物中初级感染的建立（Kaiser等人，1991，Sharman等人，2015）。最近的研究进一步证明TSV存在于生殖组织中，包括万寿菊的花和种子，并确认了种子和蓟马介导的传播，突出了生殖组织在TSV流行病学中的潜在重要性（Kumar等人，2025）。

准确的植物病毒检测和诊断对于有效病害管理和预测作物损失至关重要。基于核酸的诊断技术，包括杂交、PCR扩增和基因组测序，由于其更高的灵敏度、特异性和可重复性，已在很大程度上取代了传统的显微镜和血清学方法（Kamal等人，2013；Khan等人，2007；Kushwaha等人，2021）。可靠的分子检测依赖于从感染组织中分离出高质量且足够数量的病毒核酸（Henderson等人，1992）。然而，从秋葵中提取高质量核酸仍然具有挑战性，因为其组织含有高水平的黏液、多糖、酚类化合物、生物碱、萜类和醌类，这些物质可能与RNA共沉淀并抑制下游酶反应，如逆转录和PCR扩增（Letebrhan等人，2020，Porebski等人，1997）。Bayer等人（1999）报道，锦葵科组织的黏液性质使核酸在提取过程中难以分离，离心后常常导致核酸的大量损失。此外，多糖的粘稠和粘性干扰了移液操作，并抑制了Taq聚合酶、连接酶和限制性内切酶的活性，从而影响下游分子应用（Belletti等人，1998，Csaikl等人，1998，Fang等人，1992，Porebski等人，1997，Schlink和Reski，2002）。与类似黏液的胶体物质污染还会降低核酸在水或TE缓冲液中的溶解度（Cheng等人，2003）。此外，酚类化合物干扰核酸提取程序，降低DNA和RNA的纯度和完整性，使其不适合分子分析（Michaud等人，1995，Triboush等人，1998）。

已报道了多种用于秋葵的DNA提取方案（Adiger和Sridevi，2014，Ahmed等人，2013，Bege等人，2024，Jeyaseelan等人，2019，Jose和Usha，2000，Kumar等人，2024，Letebrhan等人，2020，Manoj-Kumar等人，2012，Sarthi等人，2024，Seth等人，2018，Singh和Kumar，2012）；然而，与RNA分离方法的优化相比，相关研究较少，而RNA分离方法对下游分子应用至关重要（Manoj-Kumar等人，2012）。因此，分子诊断和其他基于RNA的分析的成功在很大程度上取决于RNA提取方案的选择。

这一局限性在秋葵受经济重要病毒病原体TSV影响的背景下尤为重要。敏感可靠的TSV分子检测需要高质量和足够数量的RNA；然而，关于不同RNA提取方法适用于秋葵TSV检测的信息十分稀缺。此外，缺乏标准化的RNA分离方案，这成为该作物分子诊断、基因表达研究、病毒表征和病害监测的瓶颈。

因此，比较评估RNA提取方法对于确定一种可靠、经济且可重复的方案至关重要，该方案能够从不同的秋葵组织中产生无黏液的高质量RNA。鉴于这一研究空白，本研究旨在开发一种改进的SDS–LiCl方法，用于提取无黏液的高质量RNA，并将其性能与现有的CTAB–LiCl、TRIzol和RNeasy Plant Mini Kit方法进行对比，以标准化一种高效的不同秋葵组织RNA分离方案。

部分摘要

植物材料

从TSV感染的秋葵植株（35日龄，生长于2026年6–7月营养生长期，品种Arka Anamika）中采集了表现出褪绿和黄色斑块症状的幼叶，以及茎、花、果实和种子样本，这些植株种植在印度国家农业研究委员会印度园艺研究所，班加罗尔的研究田间。还从种植在防虫笼中的无症植株中采集了叶片样本作为对照。采集的叶片样本为

改进的SDS-LiCl方案标准化

SDS–LiCl提取缓冲液的优化表明，使用0.5 M和1.0 M NaCl提取的RNA含有高黏液污染，产量和纯度较低。将NaCl浓度提高至1.5 M显著减少了黏液污染，产生了产量和纯度最高的RNA，而2.0 M NaCl没有提供额外改善。在评估的PVP浓度（2%、3%和4%）中，4% PVP产生的RNA纯度最高，而2% β-巯基乙醇

讨论

本研究比较了四种RNA提取方法——改进的SDS-LiCl、CTAB-LiCl、TRIzol和RNeasy Plant Mini Kit——用于从不同的秋葵组织中分离高质量RNA，并评估其对下游病毒RNA检测试验的适用性。在所有评估的方法中，改进的SDS-LiCl方案在所有组织类型中始终产生改进的RNA质量、更高的产量和更好的扩增效率。该方案的有效性可归因于

伦理批准

本文不包含作者进行的任何涉及人类参与者的研究。

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作者使用ChatGPT（OpenAI）进行语言编辑和语法改进。作者审阅并验证了所有内容，并对最终手稿承担全部责任。

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CRediT作者贡献声明

Manamohan M：撰写——审阅与编辑、可视化、方法论。Prasannakumar N.R：资源、方法论、数据整理。Manjunatha L：撰写——审阅与编辑、方法论、概念化。Selvarajan R：撰写——审阅与编辑、方法论、调查、资金获取。Pitchaimuthu M：撰写——审阅与编辑、方法论、数据整理。Madhu G.S：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、方法论、调查、概念化。Venkataravanappa V：

利益冲突声明

作者声明他们不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

作者向印度国家农业研究委员会印度园艺研究所（ICAR-IIHR），赫萨加拉塔，班加罗尔，印度，作物保护部致以诚挚的感谢，感谢其提供进行研究所需的设施和基础设施。作者还感谢印度国家农业研究委员会（ICAR）、印度政府、新德里通过ICAR资助项目"疫苗和诊断联盟平台"提供的财政支持，

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