重组A4L、A27L和A36R蛋白用于牛结节性皮肤病病毒ELISA血清学诊断的 comparative 评价

《Journal of Virological Methods》：Comparative evaluation of recombinant A4L, A27L, and A36R proteins for ELISA-based serodiagnosis of lumpy skin disease virus

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  重组LSDV A4L、A27L和A36R蛋白在原核系统中进行了表达和纯化。
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  利用重组A4L、A27L和A36R抗原开发并优化了间接ELISA。
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  A4L ELISA表现出优越的诊断性能（AUC 0.949；DSn 93%；DSp 94%）。
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  A4L优于A27L和A36R，是高通量LSDV血清学监测的理想抗原。

引言

牛结节性皮肤病（LSD）是一种重要的跨境疾病，主要影响牛和水牛，由牛结节性皮肤病病毒（LSDV）引起。该病的特征为发热、全身性皮肤结节、淋巴结肿大、产奶量降低、不育、流产以及显著的生产损失（Kumar et al., 2026b）。发病率根据畜群的免疫状态可从5%至45%不等，死亡率通常较低，但在免疫学上的初始感染种群中可能显著增加（Toker et al., 2026）。LSD的影响不限于动物健康和生产，还通过皮张质量恶化、畜群运输和国际贸易中断，以及实施疾病监测、防控和疫苗接种策略所带来的额外经济负担，造成重大经济损失（Islam et al., 2026）。自其在非洲以外地区出现以来，该病迅速扩展至中东、欧洲和亚洲，包括印度次大陆，对牲畜生产和粮食安全构成重大威胁（Sharma and Kumar, 2025）。

LSDV是一种大型包膜病毒，具有线性双链DNA基因组，属于痘病毒科（Poxviridae）绵羊痘病毒属（Capripoxvirus）。LSD的实验室诊断依赖于分子、病毒学和血清学技术。包括常规PCR和实时定量PCR在内的分子检测方法可提供快速且灵敏的病毒DNA检测，而血清学检测方法对于流行病学调查、疫情后监测和疫苗接种项目评估至关重要（Bhat et al., 2025）。尽管病毒中和试验（VNT）被认为是检测绵羊痘病毒属（CaPV）特异性抗体的参考试验，但它耗时费力，并且需要在适当的生物安全条件下处理活病毒，限制了其在大规模血清学监测中的应用（Sthitmatee et al., 2023）。这些局限性在疾病控制、根除及根除后阶段变得更加显著。相比之下，ELISA提供了高通量筛选的实用替代方案（Kresic et al., 2020）。尽管全病毒ELISA已被广泛用于CaPV感染的血清学诊断（Babiuk et al., 2009; Baselli et al., 2025），但基于重组抗原的间接ELISA具有多项优势，包括改善的生物安全性、标准化、可扩展性和便捷生产。然而，其诊断性能很大程度上取决于免疫显性病毒抗原的选择，这些抗原应能在自然感染后激发强效且一致的抗体反应（Kushwaha et al., 2019, Teffera et al., 2025）。

约151 kb的LSDV基因组编码近156种结构蛋白、酶和免疫调节蛋白，分布于不同的病毒粒子区室中，包括细胞内成熟病毒粒子（IMV）、细胞外被病毒粒子（EEV）和病毒核心。与这些病毒粒子区室相关的蛋白在丰度、生物学功能、对宿主免疫系统的可及性和抗原特性方面各不相同，这可能影响抗体反应的强度和持续性，从而决定其作为血清学诊断靶标的适用性。已对多种重组绵羊痘病毒蛋白进行ELISA抗原评估，包括P32（Venkatesan et al., 2018, Baselli et al., 2025, Kumar et al., 2026b）、L1R（Ntombela et al., 2023, Kumar et al., 2026a）、A34R和A36R（Berguido et al., 2022）、A4L/ORF095（Bowden et al., 2009, Madhavan et al., 2023）、A27L/ORF117（Dashprakash et al., 2019, Ntombela et al., 2023）以及B5R（Angsujinda et al., 2025, Kumar et al., 2026b）。然而，多种常用抗原，包括P32、B5R和L1R，在重组蛋白表达、溶解性、纯化效率、稳定性和诊断性能方面存在局限性（Heine et al., 1999, Angsujinda et al., 2025, Kumar et al., 2026a）。

此外，大多数研究均独立评估单个抗原，使用不同的表达系统、纯化方法、试验格式、血清样本面板和验证标准，使得直接比较存在困难。因此，需要在标准化实验条件下对LSDV病毒粒子三大主要结构区室中的代表性抗原进行系统评估，以确定病毒蛋白的结构来源和生物学功能是否影响其在ELISA中的诊断性能。此类比较分析将有助于鉴定出最佳的重组抗原，用于开发灵敏、特异且可靠的间接ELISA，用于LSD的血清学诊断和大规模血清学监测（Angsujinda et al., 2025）。在这些候选蛋白中，A27L是一种免疫原性IMV表面蛋白，参与病毒附着，并被识别为中和抗体的靶点（Chung et al., 1998）。A36R是一种细胞外被病毒粒子（EEV）相关蛋白，介导细胞内运输和依赖肌动的细胞间扩散（van Eijl et al., 2000）。相比之下，A4L是一种高度保守且大量表达的病毒核心蛋白，在病毒粒子组装中起关键作用（Maa and Esteban, 1987）。这些蛋白共同代表了LSDV病毒粒子的三个不同结构和功能组成部分，为比较来自不同区室的重组抗原的诊断潜力提供了理想模型。因此，本研究旨在在原核表达系统中克隆、表达和纯化LSDV的重组A27L、A36R和A4L蛋白，并在间接ELISA中比较评估其诊断性能，用于LSD的大规模血清学监测。

章节摘要

病毒、载体和菌株

从印度北阿坎德邦穆克特什瓦尔印度农业研究理事会-印度兽医研究所（IVRI）痘病毒实验室保存的LSDV-Ntl/UK/22毒株中提取基因组DNA，用于目标基因的扩增。化学感受态大肠杆菌TOP10 F′细胞（Invitrogen，美国）用于重组质粒的克隆和扩增，而重组蛋白表达则在大肠杆菌BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL细胞（Agilent Technologies，美国）中进行，该菌株可增强

生物信息学分析和蛋白特性

生物信息学分析显示，A4L和A27L缺乏预测的跨膜结构域，而A36R含有疏水性N端跨膜区（图1）。因此，排除A36R的N端跨膜结构域以利于在大肠杆菌中进行重组表达，而选择A4L和A27L的全长编码序列用于克隆。图1展示了重组表达载体的示意图。

PCR扩增、重组蛋白表达与纯化

LSDV A4L、A27L的PCR扩增，

讨论

牛结节性皮肤病（LSD）已成为影响牛和水牛的最具经济重要性的跨境疾病之一，尤其是在印度近年报告的大规模疫情之后（Sharma and Kumar, 2025）。与传统病毒为基础的试验相比，基于重组蛋白的ELISA为大规模血清学诊断和血清学监测提供了更安全和更实用的替代方案（Tuppurainen and Oura, 2012）。然而，其诊断价值很大程度上取决于

结论

在所评估的三种重组抗原中，A4L显示出优越的诊断性能。基于A4L的间接ELISA展现出93%的诊断敏感性和94%的诊断特异性，因此代表了一种有前景的重组抗原格式，可用于常规诊断、大规模血清学监测和流行病学调查。在常规使用前，需要针对更广泛的绵羊痘病毒血清样本面板和独立表征的田间血清进行额外验证。

CRediT作者贡献声明

Aswin P. Kumar：初稿撰写、方法学、研究。G. Venkatesan：监督。Ankit Prasad Kelwan：研究。Abhishek M. Todkari：研究。Bhanupriya Sahoo：研究。Anand Kushwaha：研究。Poulinlu Golmei：研究。Amol Gurav：审阅与编辑、资源。Surega K.P.：研究。Nitish Singh Kharayat：资源。C.L. Patel：监督、资金获取。Y.P.S. Malik：监督、资金获取。Amit Kumar：撰写—

利益冲突声明

作者声明他们没有可能影响本研究工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

本研究得到印度农业研究理事会、印度政府农业研究教育部的支持。作者感谢ICAR-印度兽医研究所所长和CRP-V&D项目负责人提供的必要设施以开展本研究。

Aswin P. Kumar|G. Venkatesan|Ankit Prasad Kelwan|Abhishek M. Todkari|Bhanupriya Sahoo|Anand Kushwaha|Poulinlu Golmei|Amol Gurav|Surega K.P.|Nitish Singh Kharayat|C.L. Patel|Y.P.S. Malik|Amit Kumar