妊娠期泼尼松暴露导致雄性子代小鼠生育力下降：睾丸 E2f1 N6-甲基腺苷修饰的作用

《Journal of Hazardous Materials》：Gestational prednisone exposure causes subfertility in male offspring mice: Role of testicular E2f1 N6-methyladenosine modification

　　• 确认孕期泼尼松（PDN）暴露对睾丸发育的有害影响。• 将孕期PDN暴露与精子发生障碍及男性亚育性联系起来。• 睾丸E2f1的m6A升高参与了PDN引发的子代男性亚育性。• 孕期补充SAH可改善PDN引发的子代男性亚育性。## 引言泼尼松（PDN），一种人工合成的糖皮质激素，被广泛用于治疗孕妇的自身免疫性疾病和严重感染，也应用于兽医学领域[1], [2], [3], [4], [5], [6]。由于废水处理技术的局限性以及药物滥用，其残留浓度在水体和食品等各类环境介质中持续上升[7], [8]。巴西一家饮用水处理厂的一项调查发现，原水中PDN浓度高达8.1 μg/L，而经处理后的饮用水中仍有6.3 μg/L[9]。荷兰的另一份报告显示，PDN残留水平最高达2.0 μg/L，在常用处方药中居首位[10], [11]。COVID-19的传播显著增加了对PDN的需求和使用，导致更大的环境释放量和更严重的污染[12]。据报道，中国长江流域残留的PDN浓度为2.73–78.3 ng/L，远超COVID-19大流行前记录的表层水浓度（0.08–1.3 ng/L）[13], [14]。此外，在西西里岛的农场和屠宰场采集的牛肝中检测到PDN残留，水平为6.2–7.3 μg/kg[15]。因此，PDN被认为是具有潜在健康风险的新兴环境污染物[16]。人类通常通过多种介质暴露于PDN，包括水、食品和药物[6], [9], [17]。孕期PDN暴露的毒理学效应可在一定剂量下引起。早期流行病学研究表明，孕妇每日口服10 mg PDN会增加低出生体重婴儿的娩出风险[18]。大量动物研究表明，孕期PDN处理会导致出生体重降低并损害多个胎儿器官[19], [20], [21]。根据健康与疾病发育起源理论（DOHaD），孕期暴露于不利环境条件（包括药物）会加速成年期慢性疾病的发生和进展[22], [23]。近期研究表明，孕期PDN暴露导致成年子代出现肌肉骨骼疾病（2.50 mg·kg?1·d?1）、肝脂肪变性和焦虑抑郁样行为[23], [24], [25], [26], [27], [28], [29]。在另一项动物研究中，连续三周暴露于剂量大于9 mg/kg/天的泼尼松后，成年雌性小鼠的骨折愈合延迟[30]。全球疾病负担调查记录到男性不育率每年增长0.291%[31], [32]。多项系统综述表明，育龄期男性的精子质量呈渐进性下降[33], [34], [35]。一项大规模前瞻性队列研究发现，与具有最佳精子质量和生育力的男性相比，精子质量严重受损和不育的男性总体健康状况更差、寿命更短[36], [37]。因精子质量下降导致的不育已成为成年男性的主要健康问题。随着研究的深入，越来越多的研究表明精子质量下降和不育具有宫内起源[38], [39]。因此，我们假设孕期PDN暴露可能导致男性子代精子发生障碍和亚育性。然而，其潜在的底层机制尚不清楚。正常的睾丸发育包括精原细胞增殖、精母细胞减数分裂和精子形成等高度协调的过程，对精子发生至关重要[40], [41]。一项系统研究显示，N6-甲基腺苷（m6A）水平在从胚胎到成体的睾丸发育过程中逐渐升高[42]。m6A是最普遍的RNA修饰，与多种人类疾病相关，并由METTL3和METTL14等甲基转移酶以及ALKBH5和FTO等去甲基化酶动态调控[43], [44]。越来越多的证据证实m6A修饰的动态平衡对精子发生至关重要[45]。精原细胞特异性敲除Mettl3或Mettl14会抑制精原细胞分化、阻断减数分裂启动并损害精子细胞形成[46], [47]。先前的动物实验证实孕期PDN暴露增强了胎儿骨骼肌中的m6A修饰[26]。此外，近期研究显示孕期PDN暴露降低了子代皮层放射状胶质细胞中的m6A修饰水平[29]。然而，睾丸m6A修饰是否在孕期PDN暴露后子代精子质量下降中发挥作用尚不清楚。本研究首先探讨孕期PDN暴露对子代男性生育力和精子发生的影响。随后，利用基因表达芯片图谱和MeRIP-qPCR筛选出关键下调的转录因子，并调查其在子代睾丸中m6A修饰升高是否参与该过程。我们进一步构建细胞模型并开展敲低实验以验证关键机制。最后，我们用S-腺苷同型半胱氨酸（SAH，一种m6A抑制剂）处理孕鼠，以确认睾丸m6A升高在PDN引发的成年子代男性亚育性和精子发生障碍中的作用。## 章节片段### 化学试剂和药物泼尼松（PDN，LA21155）购自浙江仙琚制药公司。SAH（HY-19528）购自美国新泽西州的MedChemExpress（MCE）。泼尼松（PDN，P6254）购自Sigma-Aldrich（Sigma），泼尼松龙（PDNL，HY-17463）和细胞计数试剂盒-8（CCK8，HY-K0301）购自MedChemExpress（MCE）。两者仅用于细胞实验。针对早幼粒细胞白血病锌指蛋白（PLZF，sc-28319）、联会复合体蛋白3（SYCP3，sc-53246）和C-KIT的抗体### 孕期泼尼松暴露导致子代小鼠精子发生障碍和亚育性通过评估子代小鼠的生育力和精子质量，研究了孕期PDN暴露对子代精子发生和生育力的影响。结果显示，孕期PDN暴露显著降低了体重、怀孕率和窝产仔数（P < 0.01，P < 0.05，P < 0.01，补充图1a，图1b和c），但对男性子代的生育率和交配率无影响（P > 0.05，P > 0.05，补充图1b，c）。与对照组相比### 讨论为研究孕期PDN暴露对男性子代精子发生和生育力的影响，我们经胃灌胃给予孕鼠PDN。本研究首次提供了证据表明孕期PDN暴露抑制精原细胞增殖并导致男性子代亚育性。通过芯片图谱分析和确证实验，我们鉴定出转录因子E2f1——已知可调节细胞增殖——在睾丸精原细胞中表达下调### 结论总之，孕期PDN暴露通过升高睾丸E2f1的m6A修饰导致子代精原细胞增殖抑制和男性亚育性。我们的研究为今后关注孕期PDN暴露相关的潜在环境健康风险提供了警示和依据。**伦理审批**安徽医科大学动物实验伦理委员会已批准本研究（批准号：LLSC 20200973）。### 环境启示由于废水处理技术的局限性、药物滥用以及COVID-19的大流行，泼尼松在各类环境介质中的残留浓度持续升高。因此，PDN被认为是新兴的环境污染物，在全球范围内引起了广泛关注。近期研究表明，孕期PDN暴露导致成年子代出现肌肉骨骼疾病、肝脂肪变性和焦虑抑郁样行为。然而，### 利益冲突声明作者声明，他们没有可能影响本文工作的财务利益或个人关系。### CRediT作者贡献声明**王华：** 写作——审阅与编辑、监督、资源、项目管理、资金获取。**徐德祥：** 资源、项目管理、资金获取。**朱华龙：** 监督。**张锦：** 可视化。**吴兰兰：** 调查研究。**杜遵宇：** 调查研究。**李浩：** 方法学、形式分析。**吴心悦：** 验证、软件、方法学、调查研究、形式分析。**熊永卫：** 写作——审阅与编辑、写作——初稿、监督、项目### 利益冲突声明作者已声明无利益冲突。**致谢与资金来源：**作者感谢所有参与者提供的帮助和鼓励。图形摘要由BioRender创建。本研究由国家重点研发计划（2020YFA0803900和2022YFC27029044）以及安徽省高校优秀科技创新团队（2023AH010035）资助。Kai-Wen Wang|Wei Chang|Yong-Wei Xiong|Xin-Yue Wu|Hao Li|Zun-Yu Du|Lan-Lan Wu|Jin Zhang|Hua-Long Zhu|De-Xiang Xu|Hua Wang