新型多重RT-PCR检测方法用于脊髓灰质炎病毒检测

《International Journal of Medical Microbiology》：Development of a new RT-PCR multiplex assay for poliovirus detection

有效的疫苗可保护个体免受脊髓灰质炎（poliomyelitis）侵害，全球消灭脊髓灰质炎项目（Global Polio Eradication Program, GPEI）已取得巨大成就。不同的目标（如监测、疫情事件）需要可扩展的样本筛查。尽管基于细胞培养的分析（cell culture-based analysis）因能详细表征分离病毒而仍有必要，但其耗时且需要密集的实验室工作，从而限制了可分析的样本数量。可靠且灵敏的分子方法将提高高通量检测能力。在本研究中，研究人员设计了一种脊髓灰质炎病毒（poliovirus, PV）型特异性多重逆转录聚合酶链反应（multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction, multiplex RT-PCR）检测方法，可通过实时或数字RT-PCR对多种样本进行快速筛查。验证数据表明，该方法在灵敏度与特异性方面对不同临床标本、废水样本以及病毒分离株均表现可靠。多重检测的检测限（limit of detection, LOD）为7-50拷贝/反应，取决于PV血清型和所用PCR系统。加标废水样本的稀释系列显示，使用所设计的检测方法，数字RT-PCR对PV的可检测性较实时RT-PCR高10-100倍。所设计的检测方法可对不同样本基质进行快速PV检测，以优先安排后续分析。

脊髓灰质炎（poliomyelitis）由脊髓灰质炎病毒（poliovirus, PV）引起，虽然有效疫苗已问世，全球消灭脊髓灰质炎行动（Global Polio Eradication Program, GPEI）也大幅降低了病例数，但野生型PV1仍在巴基斯坦和阿富汗流行，而疫苗衍生脊髓灰质炎病毒（vaccine-derived poliovirus, VDPV）的传播持续威胁全球消灭进程。目前PV监测主要依赖急性弛缓性麻痹（acute flaccid paralysis, AFP）病例粪便检测和废水环境监测（environmental surveillance, ES）。传统的细胞培养病毒分离方法虽然仍为金标准，但耗时费力、检测通量低，且大多数PV感染为无症状，仅依靠AFP监测难以捕捉病毒隐匿循环，因此需要灵敏、快速、高通量的分子检测方法用于样本筛查和后续分析优先排序。

研究人员设计并验证了一种PV型特异性多重RT-PCR检测方法，可在实时RT-PCR（real-time RT-PCR, qRT-PCR）和数字RT-PCR（digital RT-PCR, dPCR或RT-dPCR）平台上运行。通过检测临床标本、废水样本和病毒分离株，证明该方法在灵敏度和特异性方面均表现可靠；多重检测的检测限（limit of detection, LOD）为7-50拷贝/反应，且数字RT-PCR对加标废水样本的检出能力比实时RT-PCR高10-100倍。该方法作为快速筛查工具，可支持不同样本基质的PV检测，并帮助实验室优先安排后续细胞培养或测序分析，为现有脊髓灰质炎监测体系提供了重要补充。

主要关键技术方法如下：研究人员使用varVAMP软件设计PV1、PV2、PV3型特异性引物和探针，靶向编码结构蛋白的P1基因组区域；采用4X CAPITAL?一步法qRT-PCR预混液在Light Cycler 480仪器上进行多重实时RT-PCR，并使用QIAcuity One系统进行数字RT-PCR。废水样本来自德国一个采样点，为2024年第23周至2025年第14周采集的24小时混合样，经聚乙二醇6000/氯化钠沉淀法浓缩后提取RNA；用于验证的临床RNA包括2013-2024年间PV阳性粪便标本、非脊髓灰质炎肠道病毒（non-polio enterovirus, NPEV）临床及废水分离株、其他胃肠道病毒RNA，以及152份临床标本（粪便、脑脊液、咽拭子）。细胞培养使用L20B和RD-A细胞系，病毒型别通过VP1 Sanger测序和纳米孔测序（direct detection of poliovirus by nanopore sequencing, DDNS）确认。

研究结果主要包括以下三个部分：

**3.1 多重RT-PCR脊髓灰质炎病毒检测方法的设计与开发**。通过varVAMP成功设计并组合PV1、PV2、PV3三个型特异性单重RT-PCR检测方法，建立多重RT-PCR，并在实时和数字PCR平台上实现。利用包含靶区域的gBlocks进行初步稀释测试，最低可检测浓度为100拷贝/μl，即5拷贝/反应。

**3.2 体外灵敏度和特异性**。使用Sabin 1和Sabin 3病毒RNA以及PV2的gBlock稀释系列，在qPCR和dPCR平台上测定LOD₉₅（95%阳性所需最低浓度）。PV1在qPCR和dPCR系统的LOD₉₅分别为8.5拷贝/反应和7拷贝/反应；PV2分别为50拷贝/反应和24.9拷贝/反应；PV3分别为16.5拷贝/反应和16拷贝/反应。型间未观察到交叉反应。在临床样本验证中，所有PV阳性样本均被正确分型，其中一例粪便样本同时检出PV1和PV2，并经DDNS纳米孔测序证实。对60株NPEV分离株及其他胃肠道病毒RNA检测未见有意义的交叉反应；152份临床标本均无PV信号。

**3.3 基于细胞培养和基于PCR的环境样本PV检测流程比较**。将Sabin 1和Sabin 3分别以10-100、10²-10³、10³-10⁴、10⁴-10⁵、10⁵-10⁶、10⁶-10⁷、10⁷-10⁸ PFU/L梯度加标到废水中，细胞培养法可检测至最低加标水平（10-100 PFU/L）；实时RT-PCR对PV1和PV3的检出下限分别为10⁴-10⁵ PFU/L和10³-10⁴ PFU/L；数字RT-PCR较实时RT-PCR灵敏度提高10-100倍，可检出100-1000 PFU/L。在40份实际废水样本筛查中，16份出现至少一个阳性数字PCR分区，10份被判定为“疑似PV阳性”，经细胞培养确认其中4份含PV，仅1份信号最强样本同时被RT-qPCR确认；所有分离株经测序均为Sabin-like PV。

讨论部分指出，数字RT-PCR的高灵敏度有利于环境监测中极低水平PV RNA的检出，可作为早期预警工具；多重检测特异性良好，PV型间无交叉反应，仅个别NPEV原型株产生弱信号。值得注意的是，研究人员在一例细胞培养阴性的粪便样本中检出PV2 RNA并经NGS确认，提示分子方法可弥补细胞培养的漏检。但RT-dPCR阳性并不能全部经细胞培养确认，可能与非感染性完整RNA或降解RNA的检出有关，因此需要进一步研究定义阳性信号解释阈值。

研究结论翻译如下：使用PV型特异性多重qRT-PCR检测临床样本和dRT-PCR检测废水样本，能够实现灵敏的高通量筛查，并可为细胞培养和测序等下游分析提供样本优先排序支持，是对现有脊髓灰质炎监测体系的有意义补充。未来研究将进一步明确细胞培养与dPCR之间的可比性。