《Foods》：Enrichment-Free Salmonella Quantification in Raw Poultry at the 1 and 10 CFU/g Decision Thresholds: A Multi-Laboratory Evaluation of the Pathotrak Concentrator with Real-Time PCR
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生禽肉中的沙门氏菌（Salmonella）是食源性疫情和产品召回的主要驱动因素，而过程控制决策日益依赖于定量阈值而非有/无检测。要在实时条件下依据阈值采取行动，需要在临界值附近实现准确定量，并在一个工作班次内获得结果。传统基于富集的计数方法无法满
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生禽肉中的沙门氏菌（Salmonella）是食源性疫情和产品召回的主要驱动因素，而过程控制决策日益依赖于定量阈值而非有/无检测。要在实时条件下依据阈值采取行动，需要在临界值附近实现准确定量，并在一个工作班次内获得结果。传统基于富集的计数方法无法满足上述要求：富集步骤在检测前增加了数小时的细菌生长时间，且生长步骤会使计数偏向于生长更快、未受胁迫的细胞。阈值附近的假阳性同样值得关注：低于限值的产品检测呈阳性，会引发代价高昂且可避免的扣留和召回。研究人员评估了一种同班次、免富集的工作流程，该流程将Pathotrak浓缩器与实时荧光定量PCR（qPCR，Bio-Rad iQ-Check Salmonella II）相结合，用于定量生禽肉中的沙门氏菌，样品制备时间约30分钟，而非6–24小时的富集。该评估涵盖三个实验室、三个日历年度（2023–2025）以及多个季节、技术人员、仪器和鸡肉来源的313次独立接种。潜在真值（latent-truth）框架将接种不确定性传播至灵敏度（sensitivity，Se）和特异度（specificity，Sp）估计中，并使每个临界值周围的半对数灰区（gray zone）变得可处理。在10 CFU/g阈值下，该工作流程对高于阈值至少0.5 log10的样品实现了Se 100%（20/20；95% CI 83.2–100.0%），对低于阈值的样品实现了Sp 94.4%（185/196；95% CI 90.2–97.2%）；在半对数灰区内，分类结果为Se 88.6%（95% CI 68.8–99.1%）/Sp 76.5%（95% CI 62.1–88.1%）（n = 77）。在跨研究比较中，10 CFU/g阈值下的灰区性能落在最可能数（most probable number，MPN）法所报告的范围内，接种菌株、鸡肉来源和平板计数方法因实验室而异。在1 CFU/g阈值下，该工作流程在一个班次内返回校准的定量结果，据研究人员所知，此前尚无免富集实时qPCR工作流程在无需孵育步骤的情况下实现这一目标。高于或低于阈值超过0.5 log10 CFU/g的样品在10 CFU/g阈值下于205/216（94.9%）例中被正确分类，在1 CFU/g阈值下于109/117（93.2%；95% CI 87.0–97.0%）例中被正确分类，分类不确定性仅限于灰区（Se 63.2%（95% CI 49.9–76.0%）/Sp 66.5%（95% CI 54.2–77.9%），n = 166），这在低拷贝数（qPCR估计的沙门氏菌基因组拷贝数）条件下符合预期。
论文解读
一、研究背景与问题
沙门氏菌是美国最主要的食源性致病菌之一，美国疾病控制与预防中心（CDC）估计每年约有135万例感染与食源性来源相关，而生禽肉是其主要储存库。行业对生禽肉的过程控制决策日益依赖定量计数而非有/无检测，原因在于工厂内部的放行或扣留决策取决于污染水平是否高于或低于某一数值临界值。目前有两个监管阈值构成了当前的决策格局：美国农业部食品安全检验局（FSIS）将1 CFU/g视为生面包屑填充非即食鸡肉产品的掺假标准（2024年5月最终确定），但该标准因现有方法（包括参考MPN法）在1 CFU/g下存在假阳性而于2025年12月被无限期推迟实施；另一个10 CFU/g标准曾于2024年8月针对生鸡胴体、分割肉和绞碎鸡肉及火鸡肉提出，但已于2025年4月被撤回。
传统方法存在两个核心瓶颈。其一，细菌富集是当前沙门氏菌工作流程的运营瓶颈：基于培养的参考方法（包括富集后平板或MPN法）需要多次孵育步骤和多天周转时间，在高通量加工厂中直接转化为延长的库存扣留和延迟的放行决策。其二，富集还引入血清型偏倚：生长更快的沙门氏菌血清型在孵育期间胜过生长较慢和受胁迫损伤的细胞，培养基和选择性条件进一步塑造富集后的群体组成，因此下游读数反映的是富集后的群体而非原始样品组成。富集方法无法可靠地区分阳性样品最初含有一个细胞还是一百个细胞，且与人类疾病更相关的血清型可能被同一样品中生长更快的菌株所掩盖。
Pathotrak平台是一种针对生禽肉的免富集样品制备方法，通过滤袋格式和压力驱动处理将细菌从食品基质中分离和浓缩，无需生长步骤。此前两项研究分别将该浓缩器与数字PCR（ddPCR）和环介导等温扩增（LAMP）相结合，证明了其在绝对定量和多重免富集检测方面的可行性。本研究将Pathotrak技术扩展到实时荧光定量PCR（qPCR）——监管机构和肉类禽业部署最广泛的检测化学平台，使用Bio-Rad iQ-Check Salmonella II检测试剂，据研究人员所知，这是首次在阈值决策框架下对iQ-Check qPCR在生禽肉中进行多实验室定量评估。
二、研究设计与主要技术方法
本研究采用多实验室协作设计，三个参与实验室在地理位置和运营特征上相互独立：美国农业部农业研究服务部东部地区研究中心（USDA-ARS，宾夕法尼亚州温德穆尔）、商业样品制备供应商实验室（Pathotrak Inc.，马里兰州劳雷尔）以及财富100强食品生产商的食品安全诊断实验室（Tyson Foods， Inc.，阿肯色州斯普林代尔）。综合数据集在16个月内（2023年12月至2025年4月）跨越三个日历年度生成，涵盖冬季、春季和夏季反应，各实验室由不同技术人员在不同仪器上执行qPCR，并从不同商业供应商独立采购鸡肉。三个实验室使用的沙门氏菌菌株各不相同：USDA使用新港血清型SN11/00，Pathotrak使用NIST提供的鼠伤寒血清型菌株，Tyson使用包含海德堡、肯塔基、鼠伤寒、姆班达卡和森夫滕贝格五种血清型的混合菌液。共分析313个qPCR反应，每个反应对应一个独立接种的鸡胸肉样品。
关键技术方法包括：Pathotrak浓缩器进行物理分离和浓缩（约30分钟样品制备）；iQ-Check Salmonella II qPCR检测（含内部扩增对照IAC）；通用内部对照调整（IC-adjusted Cq）方法，通过池化校准模型估计的IAC耦合系数（0.437）和IAC参考循环数（33.49）对目标Cq进行调整；潜在真值统计框架，将平板计数衍生的接种不确定性转化为对数正态参数，估计真实浓度超过阈值的概率，并在以阈值为中心的浓度带内通过最大似然估计灵敏度和特异度。
三、研究结果
3.1 通用内部对照调整后的各实验室剂量-反应关系
三个实验室的IC调整后目标Cq均随接种水平增加而显著下降，符合qPCR预期行为。斜率在各实验室间方向一致且幅度相似，但拟合截距存在差异：USDA相对于其他实验室表现出约?2.04个循环的截距偏移（p = 6 × 10?18），而Tyson的偏移不显著（?0.219个循环，p = 0.28）。池化通用模型估计的系数为β0 = 37.738、β1 = ?3.178（p = 8 × 10?57）、βIAC = 0.437（p = 3 × 10?12），IAC项高度显著，支持通用IC调整的使用。USDA截距偏移表现为校准中的垂直偏移而非浓度-响应关系的改变，可能与USDA使用的替代回冲程序（3 mL空气推注）有关。
3.2 运营性低于10 CFU/g范围内的实验室间一致性
在Tyson和Pathotrak Inc.实验室的数据重叠窗口（约0.8–9.6 CFU/g，完全低于10 CFU/g阈值）内，两个实验室的qPCR检出率基本一致：低亚带（≤1.5 CFU/g）为84.0%对82.5%（Δ = 1.5个百分点，Fisher精确检验p = 1.00），高亚带（5–10 CFU/g）均为100.0%（Δ = 0.0个百分点，p = 1.00）。重叠窗口内的回归分析显示Tyson相对Pathotrak Inc.的偏移为?0.50个循环（SE 0.23，p = 0.033），换算为浓度约为0.20 log10 CFU/g，小于半对数灰区半宽（±0.25 log10），因此两个实验室对近阈值样品的分类预期一致。
3.3 10 CFU/g阈值下的潜在真值阈值性能
在10 CFU/g决策阈值下，Pathotrak + qPCR工作流程对高于阈值至少0.5 log10的样品（>31.6 CFU/g）实现Se 100%（20/20；95% CI 83.2–100.0%），对低于阈值至少0.5 log10的样品（<3.16 CFU/g）实现Sp 94.4%（185/196；95% CI 90.2–97.2%）。在±0.25 log10灰区（5.62–17.8 CFU/g）内，分类结果为Se 88.6%（95% CI 68.8–99.1%）/Sp 76.5%（95% CI 62.1–88.1%）（n = 77），呈现均衡的分类特征。与Schmidt等人的比较方法相比，MPN在灰区表现出相似的均衡性（Se 76.8%；Sp 76.5%），而GENE-UP灰区特异度降低（Sp 20.8%），BAX灰区灵敏度降低（Se 8.1%）。在留一实验室交叉验证中，Pathotrak + qPCR相对平板计数几乎无偏（斜率1.06，截距?0.05，平均log10定量偏差≈?0.02，RMSE 0.57个循环）。
3.4 1 CFU/g阈值下的潜在真值阈值性能
在1 CFU/g决策阈值下，灰区（0.562–1.778 CFU/g）分类明显更困难：Se 63.2%（95% CI 49.9–76.0%）/Sp 66.5%（95% CI 54.2–77.9%）（n = 166）。性能随距阈值距离增加而改善：1.778–3.162 CFU/g带Se 96.0%（n = 25），>3.162 CFU/g带Se 93.2%（95% CI 87.0–97.0%）（n = 117）；0.316–0.562 CFU/g带Sp 100.0%（n = 5）。远低于带（<0.316 CFU/g）无观测数据，反映研究覆盖范围而非模型行为。
四、讨论与结论
讨论部分要点： 在10 CFU/g决策点，Pathotrak + qPCR是灰区中最均衡的方法之一，结合远低于带的高特异度和远高于带的高灵敏度，支持其作为同班次阈值筛查检测的应用。在1 CFU/g决策点，灰区分类困难是低拷贝阈值的预期行为，反映低拷贝检测的抽样统计而非工作流程特定缺陷——每个325 g样品仅携带数百个靶细胞，回收损失和1:6裂解液分取进一步减少扩增前的拷贝数。免富集工作流程的特异度优势在于省略了富集步骤，避免了孵育期间背景信号的放大，直接针对假阳性这一失败模式。误差堆叠分析表明，传统富集方法结合了指数细菌生长和指数DNA扩增两个复合误差项，Pathotrak平台完全消除第一个误差项，qPCR读数仍保留第二个误差项，但灰区分类平衡已落在MPN报告的范围内。USDA截距偏移的合理解释是替代回冲程序提高回收效率，IC调整提供了跨实验室的通用校准锚点。Tyson较低的R2（0.35）是接种设计范围狭窄（仅0.8–9 CFU/g，无高于阈值观测）的数学产物，而非检测性能不佳。跨方法比较需注意单位差异：本研究为CFU/g鸡肉组织（表面附着细胞），Schmidt研究为CFU/mL禽肉冲洗液（游离悬浮细胞），因此采用带相对比较而非共享绝对浓度尺度。
研究结论： 与Pathotrak前两篇论文共同确立了Pathotrak免富集前端的检测平台无关性：同一物理浓缩步骤可清洁地耦合数字PCR、等温扩增和实时荧光定量PCR，各配对中的检测行为追踪下游平台的内在精度而非受限于前端。本研究贡献三项结果：首次在生禽肉中作为计数工具对Bio-Rad iQ-Check Salmonella II检测进行多实验室定量评估；完成Pathotrak三篇论文系列，覆盖数字PCR、等温扩增和实时荧光定量PCR三个检测家族；在三个独立实验室进行多站点评估。在本数据集中，10 CFU/g阈值下的性能在跨研究、带相对意义上落在MPN报告的范围内，周转时间为同班次且无需富集步骤，通用IC调整后三个实验室在校准斜率和IAC耦合上保持一致。Pathotrak家族提供两层方法论：基于分区的配对（ddPCR、纳米板qPCR）在目前由MPN占据的参考方法角色中提供绝对定量，实时qPCR提供常规同班次阈值筛查，两者互补，选择取决于使用场景需要绝对定量还是快速阈值决策筛查。无论哪种方式，Pathotrak前端均避免了MPN所需的6–24小时富集孵育和已发表商业计数工作流程（如BAX SalQuant）所需的≥5小时富集孵育，样品制备约30分钟完成，结果在同一班次内可获得。
