染色体20q上新型推定印迹控制区差异甲基化与儿童肥胖的关联研究

《Epigenetics》：Differential methylation at novel putative imprinting control regions on chromosome 20 associated with childhood obesity

　　

摘要：DNA甲基化可能将早期生命暴露与后期肥胖风险联系起来；然而，大多数研究使用覆盖基因组不到5%的商业化芯片检测单个CpG位点，往往忽略具有生物学意义的调控区域。印迹控制区（imprinting control regions，ICRs）调控亲本来源依赖性基因表达，且富集生长和代谢相关基因，是肥胖发育编程的强候选区域。在新生儿表观遗传学研究（Newborn Epigenetics STudy，NEST）的586名参与者中，研究人员利用新型Human Imprintome Array芯片，在脐带血中对全基因组超过1,000个已表征和推定ICR进行甲基化测量。研究人员应用主成分（principal component，PC）回归和核机器（kernel machine，KM）回归，识别与持续性儿童肥胖（定义为儿童期大部分时间BMI≥95百分位）相关的出生时ICR甲基化。持续性儿童肥胖与脐带血中7个ICR的差异甲基化相关，肥胖组与正常体重组之间平均甲基化差异为2%–10%，其中包括定位于染色体20q11.1-20q11.21的新区域（ICR_1182、ICR_1179、ICR_1181、ICR_1177、ICR_1180和ICR_1165），这些区域定位到或邻近CDC27P4、LINC01597、DUX4L37和DUX4L34，以及定位到先前已表征的ZNF597/NAA60的ICR_927。大多数ICR与多个转录调控因子结合位点重叠。这些关联在8–16岁儿童后期收集的外周血中持续存在。在孕前肥胖母亲的后代中，额外识别出50个关联。按性别分层分析未发现更多信息。这些发现确定了新的ICR——尤其是染色体20q上的ICR——作为儿童肥胖的潜在早期生命表观遗传生物标志物。若经重复验证，这些稳定的ICR甲基化模式可能识别出生时即有肥胖风险的儿童，为在肥胖发生前实施针对性预防提供信息，并指导新的治疗策略。

论文解读：染色体20q新型推定印迹控制区甲基化与儿童肥胖的关联研究

**研究背景与问题**

儿童肥胖已成为全球日益严重的健康危机。2024年美国2–19岁青少年肥胖患病率达19.8%，且该比率因社会经济地位和种族而异。儿童肥胖是成年期肥胖的强预测因子，肥胖青少年在成年后维持肥胖状态的可能性是非肥胖同伴的约5倍。肥胖是心血管疾病、某些癌症、2型糖尿病和部分神经系统疾病的主要危险因素，儿童期肥胖还与这些疾病导致的全因死亡率相关。此外，肥胖儿童还面临自卑、抑郁和同伴歧视等心理伤害。基于热量摄入和运动的行为干预难以长期维持，胰高血糖素样肽-1受体激动剂（GLP-1RAs）虽前景广阔且已获批用于儿童肥胖治疗，但目前受年龄限制、成本和儿科人群中非预期及长期健康后果不确定性的制约。由于儿童期生长过程中身高增长和脂肪积累速率各不相同，迫切需要能够在肥胖模式临床显现之前识别处于持续性肥胖轨迹儿童的早期生命生物标志物。

大量证据支持早期发育过程中的环境暴露可改变表观遗传调控并增加儿童肥胖风险。与健康与疾病发育起源（DOHaD）假说一致，围孕期和产前暴露——包括母亲压力、母亲吸烟、母亲肥胖、父亲肥胖和环境污染物——可在产前发育过程中诱导表观遗传改变，其中CpG位点甲基化研究最为广泛。然而，现有研究存在若干关键局限：首先，全基因组甲基化研究常检测在整个生命过程中仍对环境响应且具有组织特异性的CpG位点，导致不同研究结果因组织类型和采样时间不同而存在差异；其次，肥胖常在单一时间点测量，而儿童期生长呈非线性特征，关联可能因脂肪积累评估时间不同而变化；最后，商业芯片的基因组覆盖度低（仅覆盖人类基因组CpG位点<5%），大量基因组区域未被探索。这些局限性凸显了识别具有已知发育稳定性的表观遗传标记并将肥胖作为持续纵向表型进行研究的需求。

**研究目的与设计**

印迹控制区（ICRs）是CpG密集的调控元件，通过差异等位基因DNA甲基化沉默亲本一方的等位基因，建立并维持印记基因的亲本来源特异性单等位基因表达。ICR甲基化在生殖系中建立，并在早期胚胎中抵抗全局表观遗传甲基化重编程，因此在胚层特化之前已设定，并在胚胎组织分化过程中以高保真度维持。这种空间和时间上的甲基化稳定性使ICRs成为早期识别肥胖易感性的有吸引力的生物标志物候选靶点。尽管ICRs具有重要性，但直到最近才仅有约24个调控约200个基因的ICR被表征。随着全基因组测序和计算能力的进步，已有超过1,000个新的推定ICR被识别。然而，与实验验证的ICR不同，这些推定ICR在调控基因组印记和体细胞组织中等位基因特异性甲基化模式建立方面的作用尚未得到实验证实。

研究人员利用新型Human Imprintome Array芯片（可靶向>70%已表征和新识别的推定ICR，而EPICv1芯片仅覆盖10.5%），在2005–2011年于美国北卡罗来纳州达勒姆市入组的纽黑文新生儿表观遗传学研究（NEST）队列中开展研究。纳入分析的586对母儿中，研究人员在出生时脐带血中测量全基因组超过1,000个已表征和推定ICR的甲基化，并利用纵向BMI和人体测量数据，评估脐带血DNA甲基化模式与儿童期及青春期外周血中甲基化模式的持续性。研究采用主成分（PC）回归和核机器（KM）回归两种互补的统计方法来评估ICR内潜在相关CpG位点的联合效应，识别与持续性儿童肥胖相关的出生时ICR甲基化。

**主要技术方法**

研究使用Human Imprintome Array BeadChip芯片测量DNA甲基化，DNA提取自出生时收集的脐带血和后续随访时收集的外周血。预处理使用SeSAMe包，采用非线性染料偏倚校正和NOOB背景减法方法进行标准化。质量控制在探针和个体水平实施，最终CpG Beta矩阵包含6,711个CpG位点，对应1,022个ICR。统计分析中，研究人员首先通过逻辑回归检验每个CpG与肥胖结局的关联，然后在ICR水平上使用PC回归和KM回归评估潜在相关CpG位点的联合效应。PC回归通过提取解释大部分总CpG方差的前几个主成分并在逻辑回归模型中评估其联合效应；KM回归通过线性核函数建模ICR内所有CpG对肥胖风险的聚合贡献。此外还进行了基于ICR内CpG平均甲基化的敏感性分析、按儿童性别和母亲孕前肥胖分层的分析、ICR甲基化稳定性分析（使用Pearson相关系数）以及功能通路分析（使用QIAGEN Ingenuity Pathway Analysis，IPA）。

**研究结果**

**受试者特征**：586对母儿中，持续性肥胖患病率为10.4%（n=61），间歇性肥胖为18.4%（n=108）。孕前肥胖母亲的后代显著更可能表现持续性肥胖（β=1.18，95%CI: 0.63–1.73；p=2.54×10??）或间歇性肥胖（β=1.09，95%CI: 0.65–1.52；p=9.70×10??）。

**与持续性儿童肥胖相关的推定印迹控制区**：CpG水平逻辑回归分析显示，校正协变量和多重比较后，持续性肥胖与11个显著CpG（q<0.05）相关，对应5个ICR——1个映射到已知印记基因，4个为新区域。这些ICR（ICR_1182、ICR_1179、ICR_1181、ICR_1165和ICR_927）大小范围为212–1,039碱基对，包含4–21个CpG位点，映射到或邻近CDC27P4、LINC01597、DUX4L34和ZNF597/NAA60。利用PC回归和KM回归进一步支持了这些发现，并识别出另外两个同样定位于染色体20同一区域的ICR（ICR_1177和ICR_1180）。86%的CpG位点在持续性肥胖组中显示高甲基化。在基于平均甲基化的敏感性分析中，仅ICR_1179和ICR_1182保持统计学显著。

**与间歇性儿童肥胖相关的印迹控制区**：正常体重与间歇性肥胖比较产生一个显著CpG（q<0.05）和ICR水平显著性（PC回归q<0.05）的ICR_888，该ICR位于NDN内，NDN是15q11.2上已知的父源表达印记基因，与普拉德-威利综合征相关。

**孕前肥胖母亲后代中的关联**：按孕前母亲肥胖分层后，尽管样本量较小（111名正常体重儿童和33名持续性肥胖儿童），分析仍识别出54个与持续性儿童肥胖相关的显著ICR（PC或KM回归q<0.05），其中4个与未分层分析重叠。不重叠的ICR中，4个位于已知印记结构域内：GNAS、PEG10、KCNQ1和SVOPL。按儿童性别分层未发现显著ICR。

**染色体20q新候选ICR的证据**：染色体20q11.1–20q11.21上由ICR_1165、ICR_1177、ICR_1179、ICR_1180、ICR_1181和ICR_1182组成的显著性位点簇提示存在一个先前未识别的连续调控结构域。ICR_1182及其邻近ICR_1183中20个CpG位点有19个在持续性肥胖儿童中显示高甲基化。支持该位点为候选ICR的证据包括：与等位基因特异性调控一致的生殖系甲基化模式、跨三个胚层体细胞组织中稳定的约50%甲基化谱、与包括CTCF在内的重要染色质调控因子结合位点的共定位。

**ICR从出生到儿童后期/青春期的稳定性**：对于未分层分析中与持续性肥胖显著相关的ICR，研究人员通过计算Pearson相关系数和比较组间平均甲基化水平，评估了这些甲基化标记在出生脐带血与8–16岁外周血中的持续性。染色体20上六个ICR在两个时间点间的甲基化相关性极高，正常体重组Pearson相关系数范围为0.71–0.91，持续性肥胖组为0.68–0.85。ICR_927在出生和后期测量间无相关性。大多数ICR在出生和儿童后期/青春期之间的组平均变化小于1%，仅ICR_1182在PC回归校正后p值保持在0.05以下。

**与既往研究比较**：与既往使用450K或EPIC芯片的儿童肥胖表观遗传研究相比，单个CpG水平重叠有限，但在基因水平上出现大量重叠。共有65个基因在未分层或分层分析中与既往研究报告的显著基因重叠，其中包括12个已表征印记基因（BLCAP、NNAT、DLGAP2、GLI3、GNAS、KCNQ1、KCNQ1DN、MAGEL2、MEST、PEG3、PTPRN2和SVOPL）和5个位于或邻近ADARB2、CRYL1、OPCML、TBCD和TRAPPC9的新推定ICR。

**功能通路分析**：对58个映射到q<0.05的CpG或ICR的基因进行IPA分析，前20条显著通路涉及能量稳态、脂肪组织生物学、代谢信号、炎症和免疫相关通路（如IL-4、IL-10、IL-13和巨噬细胞替代激活信号）、神经内分泌和神经元信号通路（如促肾上腺皮质激素释放激素信号、谷氨酸能受体信号和睡眠相关通路）。多个显著ICR映射到MAPK1、GNAS和CREB5等基因，这些基因在多个富集通路中反复出现。

**讨论与结论**

讨论部分指出，利用新型Human Imprintome Array，研究人员测试了出生时印迹控制区差异甲基化是否与纵向儿童肥胖相关以及这些甲基化差异是否持续到儿童后期。未分层分析中有8个ICR显著，其中6个位于染色体20长臂。两个ICR（ICR_927和ICR_888）位于与代谢和印记疾病相关的已知印记结构域内，其余6个代表推定新区域。在孕前肥胖母亲后代的分层分析中，共54个ICR与持续性肥胖相关，其中4个与未分层分析重叠。尽管这些发现在使用简单算术平均甲基化定义ICR的敏感性分析中不可辨别，突出了ICR水平分析方法的价值，但仍需在更大研究中重复和实验验证。大多数先前未报道的ICR占主导地位，提示这些发现可能有意义地扩展当前印记位点目录，特别是在肥胖和代谢调控背景下。持续性肥胖的效应方向和幅度随时间保持一致，支持ICR甲基化从出生至少到青春期的稳定性。

染色体20q11.1–20q11.21区域先前未被涉及儿童肥胖，因此需要在独立队列中进行重复以确立这些发现的稳健性和可重复性。Oxford Nanopore Technologies等长读长测序平台可用于评估该区域的等位基因特异性甲基化，确认该区域是否表现真正的ICR应有的等位基因特异性甲基化，细化新型推定ICR的边界，并确定相邻候选ICR是不同调控元件还是更大印记结构域的组成部分。

研究结果与印记生物学和代谢疾病一致。已确立的印记基因ZNF597与临床表现类似银-罗素综合征（SRS）的病例相关，且肥胖和2型糖尿病患者的ZNF597异常甲基化进一步提供了该基因与代谢功能障碍的关联。孕前肥胖母亲后代中识别的ICR包括GNAS、SVOPL、PEG10和KCNQ1等已知印记基因，这些基因均与肥胖和代谢调控相关。间歇性肥胖相关的ICR_888位于NDN内，NDN与MAGEL2同属黑色素瘤抗原（MAGE）家族，MAGEL2已被证实调节肥胖小鼠的瘦素受体活性。

IPA功能分析主要由母亲肥胖分层分析中识别的基因驱动，前20条通路涉及代谢、神经认知和免疫等多类生物学过程。这些通路仅由11个显著基因驱动，提示少数基因的异常甲基化可影响多个相互关联的下游通路。白色脂肪组织褐变对肥胖具有保护作用，该通路的中断可能促进肥胖发展。即使在出生时，孕前肥胖母亲所生婴儿的甲基化谱已通过多种机制和相互关联的通路为致肥胖风险做好准备。

研究存在若干局限性：Human Imprintome Array仅覆盖1,488个推定ICR中的1,088个（73.1%），探针过滤后1,022个ICR保留在分析中，部分ICR仅由单个CpG位点代表；缺乏遗传测序数据，无法评估已知影响ICR甲基化的遗传变异的贡献；BMI虽是最常用的肥胖测量指标，但无法区分肌肉质量和脂肪质量。

结论部分总结：研究人员首次提供证据表明，染色体20上新型推定ICR的甲基化变化——这些ICR在配子中建立——与儿童肥胖相关，且这些模式持续到儿童后期和青春早期。需要更大规模研究及实验证据来确定这些区域的精确边界并确认其在肥胖儿童中的失调。未来工作还应在独立人群中评估这些发现及额外的肥胖相关结局，以确定这些候选生物标志物能否在出生时预测肥胖的表观遗传易感性。