《International Journal of Molecular Sciences》：In Vitro Modeling of Sarcopenia-Related Pathology and Exercise-Associated Adaptations: Integration with In Silico Approaches
中文摘要翻译
肌少症是一种进行性、全身性的骨骼肌疾病，其主要特征为肌力下降，低肌肉量或低肌肉质量可确诊该疾病，而身体机能表现不佳则提示病情更为严重。尽管人体研究和动物模型仍然不可或缺，但其应用受到伦理考量、个体间差异、物种特异性差异、成本以及难以在全身系统中分离单一机制等因素的限制。本综述对可再现肌少症相关选择性病理表型的体外模型、用于研究运动关联适应的实验方法以及用于转化性基准评估的计算生物学（in silico）方法进行了批判性评估。研究人员根据所模拟的表型、主要终点指标、优势及局限性，对肌源性细胞培养体系、三维工程化肌肉组织、衰老诱导系统及微生理平台进行了比较。随后，研究人员评估了电脉冲刺激（EPS）、机械牵张及通路靶向药理学探针，将其作为研究收缩相关、负荷敏感、体液及代谢反应的还原主义工具，而非用于再现整体运动。最后，研究人员讨论了多组学分析、机器学习、深度学习、公共转录组数据集及细胞类型感知分析如何能够在考虑批次效应、数据集异质性、细胞组成混杂、过拟合、可解释性及外部验证的前提下，将体外特征谱与体内数据进行基准比对。将经实验验证的发现与明确标识为假设生成性质的观察结果进行整合，可有助于优化模型选择、在适当情况下减少对动物实验的依赖，并加速开发在衰老过程中维持骨骼肌功能的干预策略。
论文主体内容总结
1. 引言
根据EWGSOP2（欧洲老年人肌少症工作组2）框架，肌少症是一种进行性、全身性的骨骼肌疾病，低肌力提示可能存在肌少症，低肌肉量或低肌肉质量可确诊，而身体机能表现不佳则提示严重肌少症。肌少症虽最常见于老年人，但也可能在生命早期发生，不应仅等同于肌肉量的减少。该疾病与衰弱、跌倒、残疾、住院及死亡风险增加相关，给全球医疗系统带来沉重社会经济负担。
在机制层面，肌少症的发生发展涉及多个相互关联的生物学过程，包括肌肉蛋白合成与降解之间的失衡、线粒体功能障碍、氧化应激、慢性低度炎症、卫星细胞再生能力受损、神经肌肉接头退变、性激素改变及细胞衰老等。这些过程可共同损害肌肉质量与功能，但其中任何一个过程都不等同于肌少症，也不足以单独构成该疾病的完整实验模型。
为阐明肌少症的生物学机制，研究者传统上依赖人体肌肉活检及体内动物模型。人体来源组织具有临床相关性，但受伦理限制、组织获取有限、采样具有侵入性及供体间异质性等制约。动物模型则需要较长时间才能发展出衰老表型，维护成本高，且可能因物种差异而无法完全再现人类生理。此外，全身系统的复杂性使得难以在不受到全身及器官间相互作用干扰的情况下分离单一分子通路。
鉴于上述局限，体外与计算生物学方法已作为人类及动物研究的补充平台而出现。体外系统包括永生化成肌细胞系、原代骨骼肌细胞及诱导多能干细胞来源的肌源性细胞，以及三维生物工程肌肉构建体。这些系统允许在受控条件下研究单个病理特征，包括肌管萎缩、氧化应激、炎症、线粒体功能障碍及细胞衰老。分解代谢及应激相关刺激可用于在明确实验条件下再现肌少症相关选择性表型，但这些还原主义表型不应被解释为该临床疾病的完整模型。
在病理建模之外，体外方法越来越多地用于研究选择性运动关联适应。这些方法包括基于收缩的电脉冲刺激、机械牵张、运动条件化血清或血浆、运动响应性肌因子和外泌因子，以及通路靶向药理学探针。这些方法均不能完整再现整体运动，而是各自分离有限的生物学输入或响应。因此，本综述使用"运动关联适应"作为总括术语，并将"运动模拟剂"保留用于旨在激活选择性运动响应通路的药理学制剂。
近期技术进步扩展了体外骨骼肌模型的能力。传统二维培养已由三维工程化肌肉组织、骨骼肌类器官及器官芯片平台所补充。与二维单层培养相比，这些先进平台能更好地再现天然骨骼肌的特定结构与功能特征，并可评估收缩功能、多细胞相互作用、细胞外基质重塑、营养灌注及机械负荷。然而，更高的结构复杂性本身并不构成完整的肌少症模型，所模拟的表型、细胞组成、成熟状态及验证终点必须明确界定。
与此同时，计算生物学方法为解释和基准比对肌少症相关体外模型提供了补充层面。公共转录组及多组学数据集、系统生物学分析以及机器学习和深度学习方法可用于将体外特征谱与人类骨骼肌、失活动和运动响应数据集进行比较，并优先筛选候选生物标志物、通路及干预措施。细胞类型反卷积和单细胞参考图谱可进一步帮助区分肌纤维内在信号与组织细胞组成变化。
2. 肌少症相关病理的体外建模
2.1 细胞来源与三维生物工程
传统二维单层培养可在明确肌源细胞群中受控诱导肌原性分化受损、肌管萎缩、蛋白质稳态改变、线粒体功能障碍、炎症信号或细胞衰老。常用细胞来源包括小鼠C2C12和大鼠L6细胞系、人原代成肌细胞及人多能干细胞来源的肌源性祖细胞。这些系统在物种来源、生物学保真度、可重复性、成熟状态及分子或功能终点适用性方面存在显著差异。
人原代成肌细胞和供体来源的iPSC模型可提高人类相关性并实现供体特异性分析，但也引入生物学和技术变异性。原代细胞研究应报告供体年龄、性别、合并症、用药及体力活动史、活检部位、分离方法、细胞纯度、传代次数及培养时长。供体年龄和性别可影响人肌肉祖细胞的扩增和代谢特征，而长期培养和反复传代可改变其增殖和分化能力。对于iPSC来源系统，还需考虑克隆间变异和分化成熟度。此外，通过多能状态重编程可重置年龄相关细胞特征，可能削弱用于代表晚年肌少症的iPSC来源模型的保真度。
在这些系统中，常用糖皮质激素、促炎信号、氧化应激、代谢应激物及衰老相关扰动来诱导分解代谢或衰老相关条件。由于每种干预分离不同的生物学应激源，所得读数不应被解释为肌少症的可互换表征。这些系统提供的是用于测试预定义表型和机制的可实验操作平台。
为克服二维单层培养的结构和功能局限，三维工程化肌肉组织已被开发为更具生理信息量的平台。这些系统通常将肌源细胞嵌入由天然细胞外基质蛋白或组织特异性脱细胞细胞外基质组成的水凝胶基质中。基质锚定和单轴张力促进肌管排列，并允许评估组织水平形态和收缩功能。这些平台还可适配多细胞共培养系统，特别是纳入运动神经元以研究肌肉-神经相互作用和功能性神经肌肉接头样连接。内皮细胞和基质成纤维细胞也被纳入更特化的构建体以促进内皮网络形成、血管组织及灌注相关功能。然而，当前三维工程化肌肉组织仍不完全成熟，无法再现人类骨骼肌的全身调控、完全发育的血管化或复杂衰老环境。
2.2 持续氧化应激用于衰老相关表型建模
在氧化应激方法中，外源性过氧化氢的团注暴露常用于诱导培养骨骼肌细胞的活性氧介导损伤。生物学结果强烈依赖于暴露浓度和时长：过氧化氢可诱导氧化损伤和肌管萎缩，而更高或更长时间的暴露可激活广泛的凋亡信号。因此，该方法更适合被解释为急性氧化损伤模型，而非肌少症相关细胞衰老的完整表征。肌少症通过慢性和累积性骨骼肌稳态紊乱发展，包括线粒体功能障碍、持续氧化还原失衡、蛋白质稳态受损、持续DNA损伤反应及细胞衰老。
为提供更持续的氧化刺激，Wei等人开发了含葡萄糖氧化酶的过氧化氢释放水凝胶，该水凝胶可将从培养基中扩散的葡萄糖持续且可控地转化为过氧化氢。在C2C12培养中，该水凝胶暴露诱导了衰老相关变化，包括衰老相关β-半乳糖苷酶活性增加、γH2AX积累、细胞周期阻滞、增殖能力降低以及p16和p21表达增加。该平台还被适配至三维脑类器官模型和报告基因溶衰药筛选。然而，该平台尚未在三维工程化骨骼肌中得到验证，也未与老年人骨骼肌进行基准比对，其与运动关联刺激的兼容性仍未测试。
3. 运动关联适应的体外建模及组学分析
3.1 电脉冲刺激作为基于收缩的模型
电脉冲刺激是一种基于收缩的体外方法，用于再现骨骼肌收缩活动的选择性细胞后果。可编程电脉冲通过培养兼容电极诱导膜去极化、细胞内钙循环及分化肌管中的重复收缩活动，无需完整运动神经元输入。由于所得响应强烈依赖于刺激参数，方案选择应与预设的收缩、代谢或转录终点相关联，而非被宽泛解释为耐力或抗阻运动的直接体外等价物。
在二维肌管培养中，电脉冲刺激特别适用于研究收缩诱导的分子和代谢响应。研究报道了钙依赖和AMPK相关信号激活、葡萄糖摄取和脂肪酸氧化增加，以及与线粒体和肌原纤维重塑相关的转录变化。在培养的人骨骼肌细胞中，收缩活动还被证明可通过抑制促炎信号来预防实验诱导的胰岛素抵抗。然而，二维单层缺乏组织水平排列、被动张力和直接力传递，更适合分子、转录和代谢终点，而非评估整合收缩生理。
在三维工程化肌肉组织中，电刺激可应用于排列整齐、基质锚定的组织，允许在组织样架构中诱导和评估重复收缩。与二维培养相比，这些系统允许同时评估分子和代谢适应以及功能结局，包括钙瞬变、单次或强直收缩力及疲劳相关响应。在组织工程人骨骼肌中，一周间歇电刺激增加了肌束大小、肌节蛋白丰度、钙瞬变幅度、强直收缩力和代谢通量，而疲劳抵抗相对于未刺激对照有所降低。
将电脉冲刺激与转录组学、蛋白质组学、代谢组学和分泌组学分析耦合，可将该平台扩展至收缩响应分子信号的鉴定。然而，在这些还原主义系统中鉴定的候选分子不应自动被归类为生理相关的运动因子，因为全身运动响应包括来自多个组织的蛋白质、代谢物、核酸和细胞外囊泡相关货物。体外分泌组谱也对培养成熟度、培养基组成、刺激参数、细胞活力及受损或死亡细胞释放的胞内蛋白污染敏感。因此，基于电脉冲刺激的组学分析应主要被视为假设生成方法。
3.2 机械牵张
机械牵张通过分离骨骼肌负荷的变形敏感组分来补充基于收缩的电脉冲刺激。在这些系统中，肌源细胞或工程化肌肉组织培养在可变形膜、弹性基质或锚定水凝胶构建体上，并暴露于由振幅、频率、方向和时长定义的静态或循环应变。与电脉冲刺激诱导膜去极化和重复收缩活动不同，机械牵张主要探测肌肉细胞如何通过细胞外基质、黏着斑、细胞骨架、肌膜相关机械传感器和肌节结构感知和响应变形。
机械牵张的生物学效应取决于应变幅度、频率、时长和培养几何结构。在原代鸡胚骨骼肌肌管中，72小时被动循环牵张通过PI3K/Akt/TOR信号诱导肥大。机械负荷也已直接与病理诱导整合于C2C12来源的三维工程化肌肉中。在地塞米松暴露之前或之后施加负荷可减轻肌管萎缩和功能恶化，并阻止地塞米松诱导的MuRF-1和MAFbx mRNA表达增加。
机械负荷与肌少症研究相关，因为衰老可改变抗阻运动的合成代谢响应和骨骼肌的机械微环境。老年男性抗阻运动后肌原纤维蛋白合成的剂量-响应关系及p70S6K和4E-BP1磷酸化较年轻男性减弱。此外，衰老骨骼肌的细胞外基质表现出增加的刚度，可将肌肉干细胞命运转向纤维化表型。机械牵张应被解释为负荷相关刺激，而非体内抗阻运动的体外再现。
3.3 通路靶向药理学运动模拟剂
药理学运动模拟剂是旨在激活与运动适应相关的选择性分子通路的化合物。由于它们不再现收缩活动、机械负荷或全身器官间信号，其体外使用应被解释为通路靶向扰动，而非完整运动模型。主要靶点包括AMP活化蛋白激酶、过氧化物酶体增殖物激活受体δ、钙依赖信号、环磷酸腺苷/蛋白激酶A信号及氧化代谢调控。
AICAR是最广泛使用的AMPK相关代谢信号药理学激活剂之一。细胞摄取后，AICAR被磷酸化为ZMP，一种激活AMPK的AMP类似物。在大鼠骨骼肌中，AICAR增加了AMPK活性、脂肪酸氧化和葡萄糖摄取。在C2C12肌管中，AICAR处理增加了AMPK激活、线粒体含量、峰值线粒体呼吸能力和线粒体生物发生相关调节因子表达，同时减少糖酵解代谢。然而，AICAR不再现耐力运动的机械、钙依赖、神经、内分泌或免疫组分。
钙动员化合物提供了另一种通路靶向方法。在非收缩L6肌管中，间歇性离子霉素或咖啡因暴露每天5小时增加了线粒体酶水平，而连续离子霉素暴露5天导致每个培养皿蛋白质减少约40%。骨骼肌特异性表达组成性活性CaMKIV的转基因小鼠增加了线粒体DNA复制、线粒体生物发生、线粒体酶表达和PGC-1表达。咖啡因和离子霉素最适合用作钙动员机制探针。
其他药理学化合物靶向离散代谢或第二信使通路。毛喉素直接激活腺苷酸环化酶并升高细胞内cAMP，允许研究cAMP/PKA/CREB信号。选择性PPARβ/δ激动剂GW501516增加了骨骼肌细胞中优先脂质利用、β氧化、胆固醇外排和能量解偶联相关基因的表达。棕榈酸酯应被分类为脂毒性病理应激源而非运动模拟剂，它诱导胰岛素抵抗和肌管丢失。药理学运动模拟剂最适合作为机制探针，保护效应证据应要求预定义病理终点的改善，而非仅激活靶向信号通路。
4. 计算生物学预测建模、机器学习分类器及细胞类型感知候选生物标志物优先筛选
4.1 基于深度学习的体外运动关联适应基准比对及候选肌因子优先筛选
Lee等人提供了体外收缩模型跨数据集深度学习方法基准比对的代表性示例。分化C2C12肌管接受24小时电脉冲刺激，RNA测序鉴定出774个差异表达基因。这些基因用于构建深度信念网络分类器，随后应用于九个公开骨骼肌运动数据集。分类器将60个静坐样本中的50个归为对照类，48个运动样本中的32个归为电脉冲刺激类。该分析的价值不在于证明电脉冲刺激再现整体运动，而在于描绘可在收缩肌管内引发的转录程序。电脉冲刺激分离肌管内在和自分泌响应，同时排除体内运动的主要组分。
计算基准比对还可支持候选肌因子优先筛选。Lee等人筛选了编码细胞外蛋白的电脉冲刺激响应基因，鉴定出双调蛋白作为候选运动响应肌因子。在C2C12肌管中，电脉冲刺激增加了Areg mRNA表达和条件培养基中AREG蛋白丰度，而Areg表达在小鼠骨骼肌急性最大运动后也升高。Burzyn等人表明调节性T细胞来源的AREG在体外直接作用于肌肉卫星细胞并改善小鼠损伤后肌肉修复。AREG应被视为候选运动响应肌因子，而非已验证的肌少症导向治疗靶点。
4.2 年龄和运动相关骨骼肌转录组状态的机器学习分类
机器学习也可应用于公共人类骨骼肌转录组数据集以检查年龄和运动相关分子状态。Baek等人对两个公共骨骼肌转录组数据集进行了示例性再分析。GSE8479最初生成用于比较年轻和年长成人抗阻训练前后的骨骼肌。主成分分析、逻辑回归和决策树建模鉴定出USP54和ATP1B4作为可贡献于年龄和训练相关转录组状态分类的候选特征。对GSE28422的类似探索性分析鉴定出DMRT2和PRND作为候选决策树特征。这些基因应被视为示例性候选分类器特征，直到其可重复性在独立队列中得到证明且其生物学相关性在转录、蛋白质、细胞和功能水平得到确认。
4.3 批量转录组学的细胞类型感知解释及单细胞参考图谱
MetaMEx整合了66个已发表人类骨骼肌转录组数据集，代表1100多个个体，允许跨运动方式、急性运动与训练、参与者表型和采样相关变量检查响应。然而，大多数贡献数据集来自批量肌肉活检，所得表达值代表多个细胞群信号的混合。批量表达变化可能反映稳定细胞群内转录改变、细胞丰度变化或两者兼有。
细胞类型表达资源有助于细化这一解释。比较分析表明PPARGC1A、AKT1、SLC2A4、MAPK1和COX4I1等转录本相对富集于骨骼肌或肌源组分，而MTOR和RPS6KB1等转录本也可能由非肌源细胞群贡献。参考引导反卷积提供了更系统的方法。CIBERSORTx可估计细胞类型丰度并从批量谱推断细胞类型特异性表达，而MuSiC使用多受试者单细胞参考数据估计细胞比例。细胞类型感知解释也指导体外模型选择。当候选响应一致定位于肌源组分时，电脉冲刺激处理的肌管或通路靶向药理学模型可能适合机制测试。当响应依赖于内皮-肌源通信、免疫-基质信号、纤维脂肪祖细胞重塑或卫星细胞-微环境相互作用时，肌管单培养不太可能捕获完整机制。
4.4 方法学局限及分层验证框架
跨研究转录组整合易受技术批次效应和生物学异质性影响。ComBat等批次调整方法可减少不想要的技术变异，但当生物学组在批次间分布不均或目标表型与批次混杂时，校正可能减弱真实生物学差异或产生过度置信。过拟合是另一个关注点，当数千个分子特征在相对较少样本的队列中分析时尤为突出。所有数据依赖程序应在每个验证折的训练数据内执行以防止信息泄漏。嵌套交叉验证提供偏差更小的泛化性估计，但内部交叉验证不能替代真正独立队列中的测试。
计算发现可使用四层验证框架组织。第1级包括单数据集内的发现，应被视为假设生成。第2级要求在独立数据集或跨分析平台复制，并具有一致方向性和生物学合理的细胞类型定位。第3级要求在适当体外系统中进行靶向实验确认。第4级要求在动物模型或人类队列中使用与肌少症相关的功能终点进行生理验证。在该框架下，USP54、ATP1B4、DMRT2和PRND仍为第1级候选标记。AREG具有额外跨背景和蛋白质水平支持，但尚未被因果验证为肌少症特异性运动关联适应介质。
基于原子和结构的计算方法可补充转录组学和机器学习分析，通过评估候选通路靶向运动模拟剂的结合模式、稳定性和靶标选择性。分子建模可在组学或通路水平发现与靶向实验验证之间提供机制桥梁，但其在肌少症中的应用仍处于早期阶段。
5. 结论与未来展望
5.1 结论
肌少症研究正超越对年龄相关肌肉衰退的描述性叙述，转向研究定义病理和运动响应信号如何影响骨骼肌衰老的实验系统。人类和动物研究仍然不可或缺，但伦理限制、成本、个体间变异、物种差异和全身复杂性可能限制单个机制的分离。体外和计算生物学平台应被视为在受控条件下研究肌少症相关表型和运动关联适应的补充系统，而非生物体模型的替代品或肌少症的完整模型。
当代体外建模的主要优势在于其分离、组合和比较骨骼肌生物学不同维度的能力。定义病理刺激可再现肌少症相关的选择性细胞特征，而电脉冲刺激、机械牵张和通路靶向药理学探针提供用于研究收缩相关、负荷敏感和代谢信号通路的还原主义工具。三维工程化肌肉组织、神经肌肉共培养、血管化构建体和微生理系统进一步扩展该框架。多组学分析与严格计算分析的耦合可进一步强化这些平台的价值。
5.2 未来展望
未来进展将取决于既具生理信息量又经严格基准比对的模型开发。患者来源iPSC肌源系统、三维工程化肌肉组织、器官芯片平台和多细胞共培养可能允许研究者检查遗传背景、衰老相关应激、运动关联刺激和细胞间通信如何在定义实验环境中相互作用。这些平台应与动物运动模型、人类运动数据集、单细胞参考图谱及收缩性、再生能力、蛋白质稳态和代谢韧性等功能终点进行比较。
人原代成肌细胞和iPSC来源模型的解释需要特别谨慎。原代成肌细胞可能保留供体特异性生物学特征，但其增殖和分化能力可因供体年龄、性别、体重指数、既往医疗处理和肌肉采样解剖部位而变化。患者来源iPSC保留供体遗传背景，但通过多能状态重编程可重置或减弱年龄相关表观遗传和转录组特征。因此，不应自动假设来自老年供体的iPSC在肌源分化后产生衰老骨骼肌表型。
一个重要未来方向是将模型复杂性与所研究的生物学问题对齐。对于主要肌纤维内在通路，还原主义系统可能足以进行机制测试。对于涉及免疫-基质重塑、内皮-肌源通信、神经肌肉相互作用或卫星细胞-微环境调节的通路，则需要更复杂平台。这种机制匹配的模型选择策略对于确定哪些发现可从受控体外系统转化至肌少症多细胞病理至关重要。
病理体外建模、运动关联刺激、多组学分析和计算生物学分析的整合为肌少症研究提供了补充框架。这些方法与3R原则一致，在适当情况下减少对动物实验的依赖，同时允许对通路靶向药理学候选物、溶衰药、再生因子和肌因子样介质进行机制筛选。其最大价值不在于取代人类或动物研究，而在于优化这些研究应解决的假设和实验优先级。
