鲸鱼Müller胶质细胞营造允许性微环境促进视网膜神经节细胞存活与神经突生长

《iScience》：Whale Müller glia create a permissive environment supporting retinal ganglion cell survival and neurite outgrowth

　　

摘要专业翻译 成年中枢神经系统（central nervous system，CNS）的再生能力有限，其中视网膜神经节细胞（retinal ganglion cells，RGCs）尤其难以修复。细胞外的胶质环境可显著影响神经元的存活与再生反应。本研究采用跨物种共培养、条件培养基（conditioned medium，CM）方法、定量蛋白质组学（quantitative proteomics）及功能干预实验，研究人员表征了来自大型须鲸的Müller胶质细胞表型，该表型可支持RGC存活与神经突延伸。与猪和鼠的Müller胶质细胞相比，鲸鱼Müller胶质细胞可增强神经元活力并促进神经突伸长。蛋白质组学分析揭示了条件培养基成分存在物种依赖性差异，包括鲸鱼条件培养基中中脑星形胶质细胞源性神经营养因子（mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF）的丰度更高，以及猪条件培养基中检测到轴突排斥蛋白纤连蛋白富亮氨酸跨膜蛋白2（fibronectin leucine-rich transmembrane protein 2，FLRT2）。仅在Müller胶质细胞存在的情况下，FLRT2抑制联合MANF可增强RGC富集培养物中部分细胞的神经突生长。这些发现鉴定了与允许性视网膜环境相关的胶质依赖性分子信号，该环境可支持神经元存活与神经突生长。

论文解读

一、研究背景与科学问题

成年哺乳动物中枢神经系统损伤后再生能力极为有限，这一现象被归因于两个层面的障碍：一是成熟神经元内在生长能力的下降，即细胞内在屏障；二是损伤微环境中缺乏物理支持且存在抑制性信号，即细胞外在屏障。视网膜神经节细胞作为中枢神经系统中研究再生机制的经典模型，其轴突损伤后不仅难以实现长距离延伸，即便成功再生也常出现路径引导缺陷，多数轴突停滞于视交叉处，仅有少数能够到达上丘或外侧膝状体等远端视觉中枢。既往促进RGC再生的策略主要集中于激活神经元发育期休眠的信号通路以克服内在屏障，或通过中和髓鞘相关抑制因子、软骨素硫酸蛋白聚糖等外在抑制分子来改善损伤环境，但功能恢复仍然有限。

Müller胶质细胞在视网膜稳态维持中发挥核心作用，已被证实通过分泌神经营养因子并触发特定细胞内信号级联来影响RGC的神经突生长。然而，不同物种来源的Müller胶质细胞对神经元支持能力的差异及其分子基础尚不清楚。研究人员偶然观察到鲸鱼来源的Müller胶质细胞能够在体外促进大鼠RGC神经突生长，这一意外发现促使他们系统比较了鲸鱼、猪和大鼠三种物种的Müller胶质细胞对RGC存活与神经突延伸的支持能力，并试图通过蛋白质组学手段解析介导这一物种差异性效应的关键分子。

二、研究内容与主要结论

研究人员建立了大鼠RGC与不同物种Müller胶质细胞的共培养体系，并制备了鲸鱼Müller胶质细胞条件培养基，系统评估了RGC存活率与神经突生长情况。结果表明，鲸鱼Müller胶质细胞共培养可将RGC存活率提升至对照条件的339.10%，条件培养基处理也可将存活率提升至289.85%。在神经突生长方面，鲸鱼Müller胶质细胞共培养条件下，超过1000 μm长神经突的RGC比例达27.39%，显著高于大鼠（16.41%）和猪（3.33%）来源的Müller胶质细胞；平均神经突长度也以鲸鱼组最高（784.72 μm）。进一步研究发现，长须鲸和塞鲸两种鲸鱼来源的Müller胶质细胞均能显著促进RGC神经突延伸，表明这一促生长特性在大型鲸类中具有保守性。值得注意的是，永生化鲸鱼Müller胶质细胞丧失了促进超长神经突生长的能力，提示永生化过程伴随表型与分泌谱的改变。

通过定量蛋白质组学分析，研究人员比较了鲸鱼和猪Müller胶质细胞条件培养基的分泌蛋白组成。鲸鱼条件培养基中鉴定到1200种蛋白，其中神经保护相关蛋白占7.4%、神经突生长正调控相关蛋白占7.1%，均显著高于猪条件培养基（747种蛋白中分别仅占3.2%和3.6%）；而神经突生长负调控相关蛋白在鲸鱼条件培养基中仅占0.2%，远低于猪的3.3%。MANF在鲸鱼条件培养基中的丰度是猪的12.0倍，而轴突排斥蛋白FLRT2仅在猪条件培养基中被检测到。功能验证实验表明，在RGC与大鼠Müller胶质细胞共培养体系中，FLRT2 siRNA沉默可促进神经突伸长，而MANF单独处理无显著效果；两者联合处理产生协同效应，使超过1000 μm神经突的RGC比例从对照的零提升至显著水平。然而在缺乏Müller胶质细胞的RGC富集培养物中，FLRT2沉默联合MANF处理并未产生任何促神经突生长效果，表明FLRT2的抑制作用是通过Müller胶质细胞间接介导的。

三、关键技术与方法

本研究采用了以下核心技术手段：跨物种共培养体系，将大鼠RGC分别与大鼠、猪、鲸鱼Müller胶质细胞共培养以比较物种差异；条件培养基制备与处理，收集鲸鱼、猪和大鼠Müller胶质细胞的无血清条件培养基用于RGC培养；定量蛋白质组学分析，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）技术对鲸鱼和猪条件培养基进行蛋白鉴定与定量，分别使用鲸鱼、人类和猪三个FASTA数据库进行检索以确保可靠性；功能干预实验，使用MANF重组蛋白和FLRT2 siRNA对共培养体系进行药理学和基因沉默处理。样本来源方面，鲸鱼眼睛来自搁浅的成年长须鲸和塞鲸各1头，死后24小时采集；猪眼来自当地屠宰场约1岁猪；大鼠眼来自2月龄雌性Sprague Dawley大鼠。

四、研究结果

大鼠RGC与鲸鱼Müller胶质细胞共培养的存活与神经突生长。 通过免疫细胞化学标记β-III-微管蛋白和波形蛋白分别识别RGC与Müller胶质细胞，研究人员发现鲸鱼Müller胶质细胞共培养显著提高RGC存活率至对照的339.10%，并显著增加具有长神经突（>200 μm）的RGC比例及其神经突长度。

大鼠、猪和鲸鱼Müller胶质细胞共培养的神经突生长比较分析。 按神经突长度分类统计显示，鲸鱼Müller胶质细胞共培养组中超过1000 μm神经突的RGC比例最高（27.39%），神经突平均长度也显著优于大鼠和猪组。原代鲸鱼Müller胶质细胞在传代4和7代时仍保持促神经突生长能力，而永生化细胞系W21M则丧失该能力。

长须鲸和塞鲸Müller胶质细胞共培养的神经突生长。 两种鲸鱼来源的Müller胶质细胞均显著增加RGC中长神经突（>200 μm）的比例和长度，证实该促生长特性在鲸类中具有跨物种保守性。

鲸鱼Müller胶质细胞条件培养基对RGC存活与神经突生长的影响。 条件培养基处理显著提高RGC存活率至289.85%，并显著增加具有延伸神经突的RGC比例和神经突长度，表明鲸鱼Müller胶质细胞分泌的可溶性因子介导了促存活和促生长效应。

鲸鱼和猪Müller胶质细胞条件培养基的蛋白质组学分析。 功能注释显示鲸鱼条件培养基富含神经保护和神经突生长正调控蛋白，而猪条件培养基中神经突生长负调控蛋白比例更高。MANF在鲸鱼条件培养基中显著富集（平均倍数变化12.0），FLRT2仅在猪条件培养基中检出。

MANF添加与FLRT2抑制对大鼠RGC神经突生长的影响。 在共培养体系中，FLRT2 siRNA沉默促进神经突伸长，与MANF联合处理产生协同效应，显著增加500–1000 μm和超过1000 μm神经突的RGC比例。但在RGC富集培养物中，相同处理无任何效果，证明FLRT2的作用依赖于Müller胶质细胞的存在。

五、讨论与结论

研究人员在讨论部分指出，鲸鱼Müller胶质细胞卓越的神经支持能力可能反映了大型海洋哺乳动物在复杂视觉环境中长期进化形成的神经维持与修复机制。蛋白质组学数据表明，鲸鱼条件培养基中神经保护因子和促神经突生长因子的富集与抑制性因子的缺失共同塑造了允许性微环境。MANF作为一种已知的神经保护因子，其促神经突生长作用具有情境依赖性，需要与FLRT2抑制联合才能发挥协同效应；而FLRT2作为轴突排斥分子，其抑制作用通过Müller胶质细胞间接调控RGC神经突生长，本研究首次采用siRNA直接抑制FLRT2并证实其促再生潜力。研究结论指出，鲸鱼Müller胶质细胞来源的分泌因子为理解神经元存活与神经突生长提供了宝贵模型，MANF与FLRT2作为关键调控分子的发现为视网膜神经退行性疾病的治疗策略开发奠定了理论基础，未来需在体内疾病模型中验证这些发现，并探索关键营养因子的递送策略。