视网膜色素上皮中的B细胞随衰老及IgM可用性变化

《iScience》：B cells in the retinal pigment epithelium change with aging and IgM availability

　　

视网膜作为负责视觉的中枢神经系统（CNS）组织，其维持在衰老过程中至关重要。历史上视网膜被视为免疫豁免部位，被认为缺乏传统免疫组分，由驻留胶质细胞维持组织完整性。新出现的证据表明，视网膜耐受性由免疫抑制而非免疫缺失所支配。本研究从视网膜色素上皮（RPE）——一个CNS屏障生态位——中分离出B淋巴细胞，并证明其激活状态和抗体库与分泌型免疫球蛋白M（IgM）的可用性及衰老相关。在缺乏分泌型IgM的情况下，从RPE分离的B细胞表现出更激活的表型和改变的B细胞受体（BCR）库，衰老进一步修饰VH使用、CDR-H3特性及克隆扩增。在功能上，RPE B细胞在刺激后可分泌抗体。这些发现为理解CNS屏障组织中的体液调节以及免疫功能与视网膜衰老和健康之间的关联机制奠定了基础。

论文解读

一、研究背景与科学问题

视网膜是负责视觉的中枢神经系统（CNS）组织，其稳态维持对衰老过程中的视觉功能至关重要。历史上，视网膜被视为免疫豁免部位，长期被理解为缺乏经典免疫活动，所有免疫支持由驻留视网膜胶质细胞提供。然而，近年来的研究提示，免疫豁免并非免疫缺失，而是一种受控的、主动调节的免疫环境，允许眼部和系统性免疫细胞之间进行选择性相互作用。既往视网膜免疫研究主要聚焦于小胶质细胞，近年来也涉及T细胞，但B细胞在眼部隔室中的存在和功能作用仍知之甚少。

在CNS中，B细胞日益被认为是免疫调节和病理过程中的关键参与者，与多发性硬化、视神经脊髓炎等多种CNS疾病密切相关。然而，B细胞在稳态条件下——尤其是在视网膜中——的存在很少受到关注。研究人员此前发现，B细胞来源的IgM在衰老过程中对维持小鼠视网膜稳态具有保护作用。基于这一发现，本研究旨在确定B细胞是否存在于衰老小鼠的眼部隔室中，并探究眼部微环境变化——包括分泌型IgM缺失和衰老——如何影响从RPE分离的B细胞的表型、功能和抗体库。

二、研究内容与主要发现

研究人员在年轻（3–4月龄）和年老（18–26月龄）的野生型（WT）小鼠及无法分泌IgM的μs^?/?小鼠中，通过精细解剖分离神经视网膜、视网膜色素上皮（RPE）和脉络膜/巩膜（C/S）三个后眼部隔室，经酶消化制备单细胞悬液后进行CD19阳性分选，系统研究了RPE中CD19⁺ B细胞的存在、表型、功能及抗体库特征。

三、关键技术方法

研究人员采用的主要技术方法包括：精细组织解剖与酶消化制备眼部各层单细胞悬液，通过磁珠阳性选择和流式细胞术分选CD19⁺ B细胞；利用流式细胞术进行免疫表型分析；通过脂多糖（LPS）体外刺激培养评估B细胞抗体分泌功能，并用ELISA定量IgM；采用单细胞V(D)J测序分析B细胞受体（BCR）重链库；通过RT-qPCR验证组织分离纯度。小鼠品系包括C57BL/6J野生型小鼠及B6;129S4-Ighm^tm1Che（μs^?/?）小鼠，后者经回交至C57BL/6J背景（纯度>94%），雌雄小鼠均纳入实验，未观察到性别相关差异。

四、研究结果

CD19⁺ B细胞存在于后眼部的视网膜色素上皮中

研究人员首先分析了已发表的神经视网膜bulk RNA-seq数据集（NCBI GEO: GSE156758），发现CD19及其他B细胞相关基因存在低水平表达。随后通过解剖分离三个后眼部隔室并进行CD19阳性分选，发现活CD19⁺ B细胞的主要定位在RPE层（1.8%），而神经视网膜中极少（0.035%）。组织纯度通过RT-qPCR确认，RPE样本中未检测到内皮标志物（vWF、CDH5）表达，排除了血管污染的可能。

从RPE分离的CD19⁺ B细胞在刺激后分泌抗体

将从RPE分离的CD19⁺ B细胞经LPS刺激培养72小时后，ELISA检测上清中IgM含量。年轻WT小鼠B细胞平均产生54 ng/mL IgM，而年老WT小鼠仅产生4 ng/mL。按细胞数归一化后，年轻WT B细胞每细胞产生约0.013 ng IgM，年老WT B细胞为0.006 ng。μs^?/?小鼠B细胞不分泌IgM，与其分泌型IgM缺失一致。这证明RPE B细胞具有响应刺激并分泌抗体的功能。

从RPE分离的CD19⁺ B细胞的抗体库受年龄和分泌型IgM塑造

单细胞V(D)J测序分析显示：年轻WT小鼠RPE B细胞以V_H1使用为主（72%），而年轻μs^?/?小鼠V_H2（16%）和V_H5（20%）使用增加。年老WT小鼠V_H11使用增加（5%），年老μs^?/?小鼠V_H2（10%）、V_H6（10%）和V_H14（9%）使用增加。CDR-H3克隆扩增方面，年老WT小鼠最优势CDR-H3为ARYYGSSYAMDY（4.05%），年老μs^?/?小鼠为ARDDGSLRGFDV（8.86%）。D_H和J_H基因使用也呈现年龄和IgM依赖的差异。N-添加分析表明这些B细胞主要来源于出生后发育。

CDR-H3环的疏水性和氨基酸组成受年龄和分泌型IgM影响

年老μs^?/?小鼠RPE B细胞IgM的CDR-H3环电荷降低（疏水性增加）（?0.262 ± 0.021 vs. ?0.041 ± 0.039，p < 0.0001）。年老WT小鼠CDR-H3环疏水性与D_H基因长度呈正相关。氨基酸组成方面，年老μs^?/?小鼠酪氨酸（23% vs. 15%）、丝氨酸（9% vs. 6%）和精氨酸（13% vs. 7%）使用减少，而苏氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和缬氨酸使用增加。

RPE内CD19⁺ B细胞的表面表型

RPE中绝大多数B细胞为B220⁺CD19⁺CD5^?CD43^?表型，符合B2样细胞特征。该群细胞在年轻RPE中的数量约为C/S的6倍，年老时约为3倍。RPE B细胞表型与外周循环B细胞显著不同，后者高表达CD23和CD21，且循环中存在可检测的CD5⁺ B-1a细胞，而RPE中几乎不存在。

RPE中B220⁺CD19⁺CD5^?CD43^? B细胞为IgM⁺IgD⁺，在缺乏分泌型IgM时上调CD80和CD73

RPE B细胞主要为IgM⁺IgD⁺幼稚样表型，低表达CD23、CD21和PD-L2。在μs^?/?小鼠中，CD80（B细胞激活标志）显著增加（年轻WT: 2.89% vs. 年轻μs^?/?: 26.0%，p = 0.0071）。CD73（调节功能相关标志）在年老WT小鼠中较年轻WT增加（5.83% vs. 0.44%，p = 0.0021）。年老和μs^?/?小鼠中IgG⁺ B细胞出现增加。

五、讨论与结论

本研究表明RPE是CD19⁺ B细胞的驻留位点，其表型、激活状态和抗体库与衰老和分泌型IgM可用性相关。RPE B细胞具有B2样表型，与外周循环B细胞显著不同，且RPE中B细胞富集于相对乏血管的组织层而非高度血管化的脉络膜，排除了血管污染的解释。在缺乏分泌型IgM时，RPE B细胞上调CD80，呈现更激活的表型，可能响应屏障破坏和促炎细胞因子微环境（IL-6、IL-1β、TNFα、VEGF升高）。分泌型IgM的缺失可能使RPE B细胞朝向更炎症状态转化，这可能促成此前报道的年龄相关视网膜功能障碍。

研究局限性包括：未建立所观察到的库和CDR-H3变化的直接功能后果，未评估抗原特异性、体内抗体功能或对视网膜免疫的直接贡献；缺乏对完整RPE组织内B细胞的直接可视化，数据证明B细胞与RPE相关但未最终确定其在RPE内的驻留性。

研究结论：本研究鉴定了一群从RPE分离的B细胞，其激活状态、库组成和CDR-H3特性与年龄和分泌型IgM均相关。这些发现将视网膜凸显为一个含有独特B细胞群的动态免疫屏障组织。未来研究需确定这些B细胞如何促进局部免疫监视、调节视网膜炎症，以及控制年龄相关应激或病理的易感性，并阐明其是否为长期驻留细胞或动态招募群体。