《Applied Sciences》：Multi-Omics and Machine Learning for Predicting Foodborne Pathogen Carriage in Food-Producing Animals: Current Knowledge, Challenges, and Future Applications
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食用动物是食源性病原菌的重要储存宿主，但无症状携带和间歇性排菌使得可靠的风险分层变得复杂。多组学（Multi-Omics）与机器学习（Machine Learning）为将携带状态作为由宿主易感性、常驻微生物群、病原菌特性、功能活性及生产条件共同塑造的系统级表型进行研究提供了互补性方法。本综述评估了基于组学与机器学习方法在主要食用动物系统中理解、分类和预测病原菌携带的现有证据。现有证据在家禽中最为充分，尤其是以沙门菌（Salmonella）为重点的研究；猪和牛的研究提供了重要的微生物组、基因组及宿主反应生物标志物；而小反刍动物和水产养殖中的证据仍然有限。在所有动物-病原菌系统中，关联研究、生物标志物发现研究及同步分类研究占主导地位，而前瞻性预测和独立外部验证仍不常见。多组学与匹配的单组学或常规方法的直接头对头比较十分匮乏，其增量预测价值尚不明确。主要障碍包括结果定义不一致、间歇性排菌、生物学重复有限、技术异质性、过拟合以及外部验证不足。近期应用最可能的方向是基于风险的监测、靶向采样、群体水平优先级排序和环境早期预警。
主体内容学术总结：
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引言
食用动物是食源性病原菌的重要储存宿主，可通过肉、奶、蛋、水产品、直接接触及生产或加工环境污染传播至人类。食品安全监测的主要困难在于动物可在无可见临床症状的情况下携带并排出人畜共患细菌。携带的公共卫生意义不仅取决于病原菌存在，还涉及定植持续性、排菌强度、排菌频率以及在生产、运输、屠宰和加工过程中的传播机会。沙门菌（Salmonella enterica）、弯曲杆菌（Campylobacter spp.）、产志贺毒素大肠杆菌（STEC）、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）及食源性弧菌（Vibrio spp.）等病原菌尤为相关。常规监测方法对于病原菌检测、分离和流行病学风险评估仍然必不可少，但往往仅描述特定时间点的样本或群体状态，对决定易感性、持续性或过度排菌的生物学过程提供的信息有限。多组学方法和机器学习因此作为互补工具受到越来越多的关注。
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文献检索与证据分类
研究采用结构化叙述性文献检索策略，在Web of Science核心合集、Scopus、PubMed、CAB Abstracts和Google Scholar数据库中检索。检索词组合涵盖动物宿主、病原菌、携带相关结局、分子数据类型和分析方法等术语。合格的主要研究被分为四个互斥的证据等级：关联研究（Association）、生物标志物发现（Biomarker discovery）、同步分类（Concurrent classification）和前瞻性预测（Prospective prediction）。关联研究指比较不同携带结局的动物或样本间的生物学或管理特征差异，但不开发正式预测模型；生物标志物发现研究明确识别候选判别特征，但不在独立或时间后续数据集中进行正式预测；同步分类研究使用与目标结局同一采样阶段获得的预测因子进行分类；前瞻性预测要求预测因子在目标结局之前测量。
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概念框架：从携带关联到预测
3.1 携带与排菌的操作性定义
病原菌携带被用作动物体内或体表存在潜在致病微生物的总称，无论有无临床症状。定植（Colonization）指在宿主相关生态位中的建立和维持；无症状携带描述动物携带病原菌但无可识别疾病的状态。携带可为短暂性或持续性，排菌可为连续或间歇性。高排菌（High shedding）指排出量显著高于群体分布，超级排菌（Super-shedding）描述少数宿主对污染或传播贡献不成比例的情况。病原菌存在是二元结局，而病原菌载量是定量结局，二者均具有时间依赖性。
3.2 证据等级
四种证据等级反映了递增的时间性和验证要求。关联研究可能识别微生物群、宿主反应、代谢物或管理条件差异，但不一定表明预测或因果关系。生物标志物发现研究寻求判别携带表型的个体特征或多变量特征。同步分类模型可支持筛查或风险排序，但表征的是当前状态而非未来事件。前瞻性预测要求预测因子在目标结局之前可用，并需正式模型开发、校准、足够的提前时间和生物学独立人群中的评估。
3.3 预测单位与分析层级
预测单位是进行风险估计的生物学或操作实体，须与采样单位和干预应用单位区分。个体动物模型估计特定动物的携带或排菌状态；群体水平模型估计群体阳性率、流行率或阈值超标；农场水平模型结合生物安全、生产、气候和历史流行率数据；环境样本模型针对垫料、土壤、水、粪便、生物膜或冲洗液等基质中的病原菌存在或载量。
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食源性病原菌携带的生物学决定因素
4.1 宿主易感性与反应
宿主遗传学通过上皮功能、先天识别、炎症调节和适应性免疫的差异影响定植、组织持续性和排菌的变异。猪的全基因组关联分析已识别与沙门菌排菌、血清学反应和屠宰组织恢复相关的变异。鸡品系在盲肠携带和沙门菌肠炎攻毒后激活的转录通路方面存在差异。宿主反应是动态的，可限制定植或促进持续。年龄、生理状态、既往暴露和应激进一步修饰宿主易感性。
4.2 微生物组与代谢背景
肠道微生物群通过营养和附着位点竞争、抑制性化合物产生、局部理化条件修饰以及上皮和免疫功能支持来促进定植抵抗。最强的预测相关性证据来自病原菌暴露前的测量：鸡感染前微生物谱在后来发展为低排菌和超级排菌表型的个体间存在差异。横断面研究在其他物种中识别了相关但时间分辨率较低的模式。功能性和代谢性测量可能比单个分类群提供更可转移的信息。
4.3 病原菌适应性与宿主适应
病原菌株在黏附、侵袭、应激耐受、代谢灵活性、生物膜形成、免疫逃避和宿主外持久性方面存在差异。鼠伤寒沙门菌在鸡、猪和牛中的功能性基因组筛选识别了一组广泛的肠道定植所需基因，包括跨宿主共享的决定因素和具有宿主特异性效应的决定因素。病原菌来源的变量在与宿主和生态背景联合解释时最具信息价值。
4.4 环境与生产背景
农场条件影响暴露和定植发生的生物学环境。饲料、圈舍、饲养密度、垫料或粪便管理、水质、抗菌药物暴露、生物安全、季节、温度、动物移动和野生动物接触均可改变病原菌引入、持续和传播。环境污染既可能是动物排菌的原因，也可能是其结果。纵向采样对于使用环境变量推断方向性至关重要。
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表征病原菌携带的组学技术
5.1 微生物组分析：宏条形码与鸟枪法宏基因组学
宏条形码测序（Metataxonomic sequencing）最常基于细菌16S核糖体核糖核酸（16S rRNA）基因，提供群落组成和多样性的经济有效描述，但分类分辨率有限且输出为成分数据。鸟枪法宏基因组学（Shotgun metagenomics）对总群落脱氧核糖核酸（DNA）进行测序，提供物种、菌株、基因、通路、毒力决定因素、抗菌药物抗性基因和移动元件的更高分辨率，但成本、计算需求和宿主DNA污染是主要限制。
5.2 宿主基因组学与转录组学
宿主基因组学测量稳定的遗传变异，可在病原菌暴露前应用，适用于早期风险估计和选择性育种。转录组学捕获采样组织中活跃表达的基因，全血谱提供系统反应的实用途径，而肠道组织更接近定植位点但通常为侵入性或仅在屠宰后可用。
5.3 病原菌基因组学与功能基因组学
分离株全基因组测序可定义菌株身份、系统发育、毒力和抗性决定因素、质粒及其他移动元件。功能基因组学方法如转座子插入测序可直接测试基因在定义定植条件下的贡献，其最大预测贡献可能在于将病原菌基因组缩减为经验证的靶向检测功能或变异集。
5.4 功能读数：宏转录组学、代谢组学与蛋白质组学
宏转录组学测量群落核糖核酸（RNA）并区分活跃表达与基因组潜力。代谢组学测量由宿主、微生物组和病原菌活性产生的小分子，可提供肠道环境的紧凑功能特征。蛋白质组学可识别参与屏障功能、免疫、代谢和病原菌适应的宿主及微生物蛋白，但直接相关的动物携带研究仍然有限。
5.5 平台与预测目标匹配
技术选择应由预期决策和采样窗口驱动。稳定的基因组标记适用于生命早期易感性评估；转录组和代谢组谱对当前生理状态更敏感；微生物组数据表征生态背景；病原菌基因组区分菌株水平变异。实际转化取决于发现特征能否转化为可重复的检测方法。
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多组学整合策略
6.1 研究对齐与数据协调
最强设计从相同动物或直接关联样本在可比时间点收集分子层。每个模态需在组合前进行适合其尺度和分布的标准化、过滤、批次校正和插补。样本标识符、采集时间和层级必须协调，使分子记录保持与正确动物、群体和农场的关联。特征数量应降低至与队列规模兼容的水平。
6.2 早期、中期与晚期整合
早期整合在建模前将所有模态的处理后特征拼接为一个矩阵，简单直接但高维层可能主导分析。中期整合将每个模态转化为低维成分、共享潜在因子或相似性网络，多组学因子分析（Multi-Omics Factor Analysis）和相似性网络融合（Similarity Network Fusion）为代表方法，DIABLO提供监督性替代方案。晚期整合为每个模态开发独立模型并随后组合预测，保留模态特异性预处理，更灵活地处理缺失模态，但不直接建模跨模态特征交互。
6.3 动物病原菌携带研究中的当前应用
当前研究代表多个整合水平。鸡的微生物组-代谢组分析连接了群落变化与沙门菌肠炎携带相关的代谢通路。其他研究将单一组学层与背景数据结合，如微生物组与理化及管理变量的联合分析，以及基于转换器架构的微生物组与农场管理特征分类。
6.4 证明增量价值与实际效用
整合模型应使用相同观测和评估方案证明对每个单独模态的增量价值。模态消融分析可澄清数据层是否贡献独特信息。成本和可行性是增量价值的一部分。对于农场应用，全面多组学最可能作为发现平台，最终工具可能由靶向检测测量的有限微生物、宿主、病原菌或代谢标记面板与少量管理变量组成。
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病原菌携带预测的机器学习
7.1 将生物学问题转化为建模任务
响应变量决定适当的建模框架。二元分类器估计阳性与阴性状态；多类模型区分低、中、高排菌表型；回归模型估计病原菌载量；纵向或时间至事件方法可建模发生、持续、复发或清除。模型应使用一个连贯的结局定义，观测结构影响模型设计。
7.2 算法选择
惩罚逻辑回归是二元结局的适当基准。基于树的方法广泛用于结构化微生物组和管理数据，随机森林（RF）建模非线性关系和交互，极端梯度提升（XGBoost）添加正则化和稀疏特征的高效处理。支持向量机在变量数相对于观测数较大时表现良好。神经网络和转换器架构可建模复杂多模态交互，但样本量和注释深度充足时才最合理。
7.3 预处理与特征缩减
预处理必须在训练数据内定义，然后不变地应用于验证数据集。任何结局知情步骤在数据分区前执行都会允许评估集信息影响模型开发。微生物组特征需特别注意稀疏性和成分性。特征缩减可使用正则化、递归消除、基于树的选择、潜在因子、通路或先验生物学知识，选择应嵌入每个训练折内。
7.4 性能评估
评估指标应与结局和类别分布匹配。准确率在阳性动物或样本不常见时可能具有误导性。敏感性和特异性描述阳性和阴性观测的检测，精确率指示阳性预测中正确的比例，F1分数平衡精确率和敏感性。受试者工作特征曲线下面积（AUC）总结跨阈值的判别能力，但精确率-召回率分析对稀有阳性类别通常更具信息性。风险模型还需要校准评估。
7.5 解释与生物标志物稳定性
回归系数、置换重要性、基于树的重要性、注意力权重和SHAP值可识别对模型输出有贡献的特征。相关变量可交换或分割重要性，高排名标记可能作为农场、饲料、年龄、测序批次或其他未测量因素的替代。可信特征应在重采样过程中重复出现，在独立队列中保持方向和重要性。
7.6 验证、比较与应用就绪
超参数调整和特征选择需要内部重采样循环，最终性能在未用于这些决策的数据中估计。嵌套交叉验证适用于小型高维数据。分区必须保留生物学分组。外部评估是转移性的主要测试。算法和数据模态应使用相同结局、预处理和分区进行比较。模型在独立人群中提供稳定性能、使用足够早的预测因子且成本与收益相称时即可进行应用评估。
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跨动物-病原菌系统的当前证据
8.1 家禽
8.1.1 沙门菌携带
实验性鸡研究提供了最完整的生物学证据集。Cazals等人发现盲肠群落组成在对沙门菌肠炎易感性对比的纯系品系间及不同携带载量的个体间存在差异。Mon等人整合了实验感染后的盲肠微生物组和代谢组测量，识别了微生物组成和代谢通路的协调变化。Kempf等人提供了最强的时间性证据，在攻毒前分析微生物群并随后将鸡分类为低排菌或超级排菌表型。农场水平工作主要聚焦于放养家禽系统内的分类。
8.1.2 弯曲杆菌携带
家禽弯曲杆菌证据更强烈地基于管理和环境数据而非整合的宿主或微生物组学。研究使用农场和加工变量分类放养家禽系统的流行率，并识别与弯曲杆菌阳性粪便样本相关的微生物组特征。
8.1.3 李斯特菌及家禽相关环境结局
李斯特菌的预测单位通常是环境或生产相关样本而非个体鸟。研究使用农场实践、环境和气象变量建模粪便和土壤样本中的李斯特菌发生。这些研究相关于农场监测，但不应被解释为稳定肠道携带预测的证据。
8.2 猪
8.2.1 沙门菌排菌的微生物组与宿主生物标志物
猪研究通过互补但大多分离的生物学层检查沙门菌排菌。研究追踪了后来发展为低排菌或高排菌表型的猪的胃肠道微生物群，将高排菌与炎症反应和微生物群破坏关联，并识别了与血清学、粪便排菌和组织定植相关的基因组变异。
8.2.2 预测模型与成熟度
Bernad-Roche等人开发了使用血清学、阳性栏比例和内部生物安全的屠宰前风险模型。猪证据生物学多样但分析碎片化，前瞻性多层整合和独立外部测试仍然缺失。
8.3 牛
大肠杆菌O157:H7超级排菌特征
牛研究集中于大肠杆菌O157:H7超级排菌表型。研究在超级排菌和非排菌育肥阉牛中识别了不同的粪便细菌群落，发现排菌相关群落差异在下肠道最明显，并在直肠组织中报告了免疫相关基因表达改变。牛具有相对强的宿主-微生物组生物标志物证据但预测成熟度有限。
8.4 小反刍动物
绵羊和山羊的证据仍主要为描述性。研究量化了羊粪便和屠宰场废水中的弯曲杆菌、沙门菌和STEC，并表征了绵羊和山羊中的沙门菌携带和血清型。这些研究建立储存宿主相关性但不提供纵向组学生物标志物或正式预测模型。
8.5 水产养殖
水产养殖研究需要生态学解释，因为动物与水体、沉积物、饲料和生物膜持续交换微生物。研究显示虾生产环境中弧菌发生随环境条件变化，当前风险评估强调温度、盐度和水质的作用。未识别出前瞻性预测个体动物携带的经验证多组学模型。
8.6 跨物种综合
在26项主要研究中，10项分类为关联研究，7项为生物标志物发现研究，8项为同步分类研究，仅1项为前瞻性预测。家禽占26项中的13项。多组学、单组学和常规预测因子集的直接比较仍然有限，现有证据不足以建立多组学对设计良好的单组学或常规方法的持续预测优势。
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方法学挑战与转化障碍
9.1 结局确定与采样设计
病原菌携带必须转化为可在动物、农场、实验室和时间点间一致测量的研究结局。诊断方法、解剖部位、检测阈值、定量截止值和观察期的差异可导致名义上相似的研究测量不同表型。采样计划应与预期决策匹配。
9.2 队列结构、生物学独立性与不平衡
高维检测常应用于适度数量的动物、群体或农场。有效样本量由独立生物学单位决定。稀有阳性动物和超级排菌者增加额外不确定性。结局富集采样可能对发现有用，但应用预测需要在现实田间流行率下验证。
9.3 技术协调与元数据质量
微生物组和其他组学谱对采集、运输、储存、提取、文库制备、仪器平台和生物信息学处理敏感。元数据同样重要，应记录动物和群体身份、农场、生产阶段、解剖部位、采样时间、诊断方法、定量病原菌结果、治疗和主要环境条件。
9.4 混杂、群体偏移与可转移性
分子特征可能预测农场身份、饲料或采样季节而非携带生物学。可转移性进一步受到品种、管理、气候、病原菌谱系和实验室工作流程差异的挑战。预期使用范围决定验证人群。
9.5 可重复性与透明报告
可重复性要求提供预处理决策、特征表、元数据字典、软件版本、调整程序、验证分区、性能不确定性和最终模型规格。独立复制必须与再分析区分。
9.6 操作、经济与治理约束
科学性能不保证操作价值。采样负担、周转时间、实验室基础设施、计算支持和成本必须适应生产决策。预测仅在触发可用且相称的响应时才有用。数据所有权、保密性和高风险分类的后果必须事先商定。
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产前食品安全中的潜在应用
10.1 基于风险的监测与靶向采样
风险评分可跨动物、群体、农场或环境位点分配监测强度。常规信息可形成第一层，组学衍生指标仅在提供可测量改进时添加。高风险预测应指导额外检测而非被视为携带的证明。持续或高排菌者的前瞻性识别可支持选择性监测、临时分离、强化卫生或修改移动实践。
10.2 干预、育种与环境决策支持
整合的生物学和背景数据可帮助优先考虑候选干预措施进行对照测试。模型重要性或相关性本身不足以证明改变特征将减少病原菌携带。组学也可监测干预后的系统级反应。经验证的宿主基因组信息可贡献于减少定植或排菌的长期育种。
10.3 证明实际效用
模型最终应由其改进的决策而非仅内部统计性能来评估。实际评估应指定预测单位、提前时间、确认测试、行动阈值、可用干预和可测量收益。目前，使用常规、管理和微生物组衍生指标的有限组合的群体、农场、批次和环境水平风险分层比常规个体动物多组学预测更可实现。
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未来研究优先事项
11.1 决策导向的前瞻性与多中心队列
前瞻性队列应跨相关生产阶段跟踪相同动物或管理群体，并包括重复的、优选定量的病原菌测量。跨独立农场、生产周期、品种和季节的招募将允许区分一般信号与位点特异性模式。
11.2 协调结局、元数据与报告
可比证据需要指定采样基质、诊断方法、检测或定量阈值、采样频率和观察期的操作性定义。报告应遵循适合微生物组研究和预测建模的标准。共享参考数据资源应包含原始和处理后数据、元数据字典、明确定义的结局和保持动物、群体、农场及生产周期独立性的预定义分区。
11.3 生物标志物的复制与因果优先化
候选特征应通过分阶段证据途径推进。发现队列中识别的特征应首先在独立动物或农场中复制，然后测试时间优先性，最后在提议为干预目标时进行实验检查。模型应缩减为在独立人群中维持性能的最小特征集，并转化为靶向测量平台。
11.4 前瞻性影响与干预研究
统计验证最终应随后进行模型辅助决策的前瞻性评估。整群随机、阶梯楔形或对照前后设计可比较标准监测与预测指导的采样或干预。影响研究还应监测动物健康、福利、生产力和抗菌药物使用。
11.5 代表性不足的系统与One Health联系
研究应扩展到家禽-沙门菌重点之外，涵盖小反刍动物、水产养殖、多样化牛和猪系统及携带表型仍表征不良的食源性病原菌。One Health研究应连接动物携带与农场环境传播、加工污染、病原菌基因组相关性和人类监测。
