《Applied Soil Ecology》：Soils sentinels: A step towards harmonisation of microbial parameters in European initiatives
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土壤健康是农业生态系统的关键组成部分，支撑着植物生长、养分循环和生态系统服务。然而，土壤在人类时间尺度上是一种不可再生资源，其退化对可持续农业构成重大挑战。尽管已有众多欧洲倡议（如LUCAS、EcoFINDERS、EXCALIBUR、SHARInG-MeD等）
土壤健康是农业生态系统的关键组成部分，支撑着植物生长、养分循环和生态系统服务。然而，土壤在人类时间尺度上是一种不可再生资源，其退化对可持续农业构成重大挑战。尽管已有众多欧洲倡议（如LUCAS、EcoFINDERS、EXCALIBUR、SHARInG-MeD等），但在标准化土壤健康指标方面仍缺乏共识，尤其是在微生物学参数方面。本综述从三个互补维度审视了欧洲土壤监测和研究倡议中当前微生物指标存在的局限性：（i）群落结构与分类；（ii）微生物丰度或生物量；（iii）微生物功能性。在群落结构与分类方面，研究探讨了宏条形码方法中的方法学差异，包括样本设计、引物选择、测序平台、读长、生物信息学流程和分类参考数据库。微生物丰度或生物量通过多种方法进行评估，包括磷脂脂肪酸（PLFA）分析、底物诱导呼吸（SIR）、酯连接脂肪酸甲酯（EL-FAME）分析、定量PCR（qPCR）和培养依赖方法，研究强调了这些方法在应用上的差异及其在跨研究比较中的局限性，以及方法学上的不一致性，特别是在基于PLFA的方法中。研究还考虑了微生物活性的功能指标，重点关注酶活性测定中的挑战、功能基因分析的标准化以及鸟枪法宏基因组学——后者可同时提供分类学和功能信息。最后，研究探讨了通过新兴的依赖情境的预测建模方法对这些变量进行整合。总体而言，本综述强调方法学异质性仍是跨研究可比性的主要障碍，并呼吁加强标准化以提升微生物生态学研究及其在生态系统功能评估中应用的稳健性。协调这些方法可增强跨项目数据整合，为欧洲可持续土壤管理的政策制定提供支持。
**论文解读：欧洲土壤健康监测中微生物指标方法学协调化的系统审视**
**一、研究背景与科学问题**
土壤作为地球关键带的核心组成部分，是一种具有生命特征的复杂系统，由固体、水和空气构成，其性质深受栖息其中并与之相互作用的生物体影响。土壤支撑着植被生长，提供生态系统服务，并生产人类大部分食物来源。然而，土壤在人类时间尺度上属于不可再生资源，其形成依赖于漫长而复杂的生态系统过程，通常需要上千年时间。土壤健康被定义为土壤持续维持生态系统、支持植物生长并保持其生物学与环境功能的能力。尽管土壤健康概念已被广泛接受，但如何标准化评估土壤健康状况始终是未解难题。
长期以来，欧洲各国在土壤健康指标选择上存在显著差异。虽然已有多个大规模监测项目和研究计划积累了大量数据，但生物学参数，尤其是微生物学指标，仍未形成统一的标准化体系。这一方法学异质性严重制约了跨项目数据整合与比较分析，阻碍了土壤健康评估向政策制定层面的有效转化。值得注意的是，2025年11月26日欧盟发布了首个土壤法律（Directive (EU) 2025/2360），建立了欧盟范围内土壤健康监测与评估的共同框架，首次将生物多样性损失通过多项指标明确纳入监测体系，包括强制性的真菌和细菌大规模DNA测序。这一立法突破虽然在政策层面迈出关键一步，但许多指标仍缺乏既定的参考值，且在退化土壤中表现不一致。在此背景下，研究人员开展了这项系统性综述，旨在全面审视欧洲土壤监测与研究倡议中微生物指标的方法学现状，识别差异与共性，为推进协调化进程提供科学依据。
**二、研究开展的工作与核心结论**
研究人员审阅了多个欧洲主要土壤监测计划和研究项目，包括LUCAS、EcoFINDERS、EXCALIBUR、SHARInG-MeD、SOILGUARD、EJP SOIL、LIFE MycoRestore、MUSGONET和Soils4Africa等，系统比较了这些倡议在微生物群落结构、微生物丰度/生物量和微生物功能性三个维度的评估方法。研究发现，尽管各项目普遍认识到生物指标对土壤健康评估的重要性——生物学指标往往比化学和物理指标更敏感、更早地响应土壤条件变化——但在具体方法选择上存在显著差异。在群落结构与分类层面，各项目在样本设计、DNA提取方案、引物选择、测序平台、生物信息学流程和分类数据库等方面均存在方法学差异；在微生物丰度与生物量层面，研究项目采用了PLFA、SIR、EL-FAME、qPCR和培养依赖方法等多种途径，导致结果指标互补但不可直接互换；在功能层面，酶活性测定、功能基因分析和鸟枪法宏基因组学的应用也缺乏统一标准。综述最终强调，方法学异质性仍是跨研究可比性的主要障碍，亟需通过协调化策略建立统一的微生物指标框架。
**三、主要关键技术方法**
研究人员比较了各欧洲倡议采用的多种关键技术：（1）基于环境DNA提取的高通量测序（HTS），包括靶向扩增子测序（宏条形码），针对细菌16S rRNA基因、真菌ITS区域和真核生物18S rRNA基因；（2）磷脂脂肪酸（PLFA）分析，用于估算活体微生物生物量和广谱群落组成；（3）定量PCR（qPCR）技术，用于定量标记基因拷贝数或功能基因丰度；（4）鸟枪法宏基因组学，可同时提供分类学和功能信息；（5）酶活性测定，包括荧光微板法和分光光度法，涵盖β-葡萄糖苷酶、酸性/碱性磷酸酶、脲酶、亮氨酸氨基肽酶和芳基硫酸酯酶等；（6）底物诱导呼吸（SIR）和多种底物诱导呼吸（MSIR）；（7）统计学和机器学习模型，包括广义加性模型（GAM）和结构方程模型（SEM）。研究还涉及来自LUCAS 2018（881个样本）、LUCAS 2022、SOILGUARD（233个样本）、EXCALIBUR（31个田间试验）、MINOTAUR/EJP SOIL（588个样本）、LIFE MycoRestore（24个样本）、MUSGONET（168个样本）、SHARInG-MeD（591个样本）和EcoFINDERS（71个样本）等项目的样本队列数据。
**四、主要研究结果**
**1. 宏条形码分析中的方法学差异**
在群落结构与分类方面，研究揭示了宏条形码分析存在的多重方法学差异。在样本设计和DNA提取方面，各项目在样本数量、采样深度、土壤用量和保存方式上各不相同：LUCAS和MINOTAUR提取3×0.20 g冷冻土壤，SOILGUARD使用3×0.25 g冻干土壤，EXCALIBUR和SHARInG-MeD分别提取16×0.40 g和3×0.50 g冷冻土壤。DNA提取主要依赖Qiagen PowerSoil和FastDNA SPIN Kit两类商业试剂盒，均基于珠磨技术并符合ISO 11063标准。引物选择方面，细菌16S rRNA基因分析中，LUCAS、MINOTAUR和SHARInG-MeD采用515F-926R引物对靶向V4-V5区域，而MUSGONET使用515F-806R靶向较短的V4区域，SOILGUARD则使用341F-806R。针对真菌ITS区域，LUCAS和MINOTAUR使用PacBio长读长测序平台，可一次读取完整ITS区域（ITS1+ITS2），而EXCALIBUR使用Illumina MiSeq平台，需在ITS1和ITS2之间选择。生物信息学流程方面，各项目在OTU聚类与ASV推断策略的选择上存在分歧：LUCAS和MINOTAUR对细菌采用zOTUs策略、真菌采用98%相似度OTU聚类，而SOILGUARD和SHARInG-MeD对所有类群采用DADA2 ASV推断。分类数据库方面，细菌最常使用RDP或SILVA数据库，真菌几乎普遍使用UNITE数据库，真核生物使用PR2或SILVA数据库。已有研究表明，参考数据库的选择可导致高达73%的门水平分类单元为单一数据库所独有。
**2. PLFA分析中的协调化挑战**
PLFA分析虽然能够区分细菌和真菌，以及在一定程度上区分革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和放线菌，但在具体操作流程上存在显著方法学变异。各研究在标准品选择、添加阶段和固相萃取（SPE）程序上各不相同：Quideau等人（2016）使用磷脂标准品PC(19:0/19:0)在首次提取前添加，并结合内标MeC10:0在气相色谱（GC）前添加；Canarini等人（2021，2024）使用脂肪酸甲酯19:0在总脂质提取后、转酯化前添加；Lewe等人（2021）在氯仿-甲醇提取过程中引入19:0；van Eekeren等人（2025）则遵循ISO 29843方法。这些差异加之各项目在微生物生物量估算方法上的选择不一——LUCAS采用SIR和EL-FAME分析，SOILGUARD、LIFE MycoRestore、MUSGONET和SHARInG-MeD采用PLFA，SOILGUARD和MINOTAUR还结合qPCR靶向16S rRNA基因——导致所得指标互补但不可直接互换。
**3. 酶活性测定中的方法学问题**
酶活性测定作为评估土壤微生物功能性的重要手段，在酶选择和测定方法上均存在异质性。在酶选择方面，LUCAS 2018评估了酸性磷酸酶、β-葡萄糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、木糖苷酶和纤维素酶；SOILGUARD在100个位点子集中测定了酸性磷酸酶、木糖苷酶、β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶；EcoFINDERS则选择芳基硫酸酯酶和酸/碱性磷酸酶。研究人员指出，β-葡萄糖苷酶和酸性磷酸酶是六个评估项目中五个项目共有的酶活性，但整体而言酶选择一致性有限。在测定方法方面，荧光微板法因其高灵敏度和高通量适用性被广泛采用，基于4-甲基伞形酮（MUF-）或7-氨基-4-甲基香豆素（AMC-）标记底物。然而，NaOH终止反应的使用与否构成一个重要变异来源：虽然NaOH可提高pH至约10（MUF荧光最大强度），但其添加后随时间推移可导致荧光信号下降。German等人（2011）建议在土壤pH高于4.5时省略NaOH步骤，以提高荧光测定的一致性。
**4. 功能基因分析与鸟枪法宏基因组学的应用进展**
在功能基因分析方面，qPCR和数字PCR主要用于定量氮和磷循环相关基因的拷贝数，而碳循环酶基因研究相对有限，这主要归因于这些基因的高度多样性和参与土壤植物聚合物分解的微生物物种范围广泛。SOILGUARD项目揭示了细菌氨氧化菌（AOB）与古菌氨氧化菌（AOA）比例随土壤管理方式的显著变化；EXCALIBUR靶向氮循环功能基因（氨单加氧酶A、亚硝酸还原酶和nifH），发现微生物种群丰度因试验地点、作物类型和管理实践而异。鸟枪法宏基因组学作为一种新兴方法，可提供群落组成和功能潜力的双重信息，但目前在大规模土壤监测中应用仍受限于约两到三倍于扩增子测序的成本、较高的计算需求以及宏基因组组装基因组的计算密集性。Bahram等人（2026）在LUCAS土壤生物多样性框架内将鸟枪法宏基因组测序应用于欧洲土地利用梯度中古菌群落功能基因组成的表征，识别出与土地利用相关的古菌功能潜力变化，特别是在集约化草地和农田中氨氧化相关功能的富集。要重建足够数量的MAGs，可能需要每样本≥5 Gb的测序深度，而恢复超过50%的KEGG通路完整性则需要>2 Gb。
**五、讨论与结论**
在讨论部分，研究人员指出，如同物理化学指标不能脱离生物指标独立解释，生物指标的理解也必须结合其物理化学和环境背景。各项目已整合生物学和物理化学测量，建模方法为整合这些多维数据提供了框架。常规回归和广义加性模型（GAMs）可量化微生物对环境梯度的响应（包括非线性关系），结构方程模型（SEM）可厘清环境条件、土壤性质、微生物群落和功能之间的直接与间接路径，而机器学习方法则进一步扩展了预测和复杂多维数据集模式检测的能力。LUCAS通过回归模型识别出土壤pH是微生物群落的主要环境驱动因素；Banerjee等人（2024）应用SEM揭示了地理、气候和土壤变量与真菌丰富度之间的直接和间接关系，发现土地利用依赖的驱动因素；SOILGUARD应用GAMs模拟微生物沿土壤和气候梯度的非线性响应。
研究结论指出，土壤健康评估仍因欧洲监测倡议缺乏标准化指标而呈现碎片化状态。基于现有证据，研究人员提出了一套互补性综合指标体系：（1）在16S rRNA基因分析中，较长扩增子（如515F-926R）可能提高系统发育分辨率；真核生物18S rRNA基因的V4区域（如Euk575F-Euk895R）被越来越多地支持为大规模协调化评估的稳健选择；ASV推断已成为16S rRNA宏条形码的推荐标准并越来越多地用于18S rRNA；真菌ITS仍是标准条形码，但OTU和ASV工作流程的选择尚无共识。（2）PLFA分析仍是估算微生物生物量的有力且广泛应用的方法，与宏条形码方法互补；当只需快速估算微生物丰度时，qPCR靶向标记基因提供了实用替代方案。（3）协调化酶学框架应至少包含每个主要生物地球化学循环的一种代表性酶：β-葡萄糖苷酶（C循环）、酸性和碱性磷酸酶（P循环）、脲酶和亮氨酸氨基肽酶（N循环）以及芳基硫酸酯酶（S循环）构成了坚实的基础核心组合。（4）分子功能基因丰度估计应谨慎解读，因其反映的是潜力而非实际活性，需与酶活性测定和生物量指标整合。（5）鸟枪法宏基因组学目前建议用于参考调查、方法学基准测试和旨在表征微生物功能潜力的项目。未来欧洲土壤监测应优先考虑协调化和互操作性，采用共同的采样策略、实验室方案、生物信息学工作流程和元数据标准，以增强统计效能、改进预测建模并加速识别稳健的土壤健康微生物指标。
