《Methods and Protocols》：Fusarium guttiforme Inoculation Methods for Resistance Phenotyping in a Segregating Pineapple Population
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由Fusarium guttiforme引起的镰刀菌病严重制约了巴西重要经济作物菠萝的生产。本研究在一个由感病品种‘Pérola’与抗病品种‘BRS Imperial’杂交获得的分离群体中，评估了两种接种与抗性表型鉴定程序。试验采用增广区组设计，包含73份杂交
由Fusarium guttiforme引起的镰刀菌病严重制约了巴西重要经济作物菠萝的生产。本研究在一个由感病品种‘Pérola’与抗病品种‘BRS Imperial’杂交获得的分离群体中，评估了两种接种与抗性表型鉴定程序。试验采用增广区组设计，包含73份杂交后代以及两个亲本作为共同对照。研究人员分别采用离体叶片接种和茎干直接接种两种程序对植株进行处理，并使用ImageJ软件定量病斑面积。所有评价性状均检测到显著的基因型效应。茎干病斑面积的基因型决定系数高于叶片性状，表明在该试验条件下茎干接种对分离个体具有更强的区分能力。最大叶部病斑面积与叶部病情进展曲线下面积呈强正相关，而两项叶部性状均与茎干病斑面积无显著关联。IBP2_70、IBP2_24和IBP1_3的调整基因型值低于抗病品种‘BRS Imperial’，被认定为后续验证的有前景候选材料。上述结果表明，两种程序均可检测基因型变异，但提供的表型信息不等效。
一、研究背景与目的
菠萝是全球重要的热带水果作物，在巴西尤其具有显著的经济价值。然而，由Fusarium guttiforme引起的镰刀菌病严重威胁着菠萝生产，该病害可侵染种植材料、成株和果实，导致组织腐烂、流胶等症状，使果实丧失商品价值。在感病品种如‘Pérola’中，病害管理依赖栽培措施、健康种苗和频繁施用杀菌剂，不仅增加生产成本，防治效果也不稳定。因此，培育抗病品种成为可持续防控的重要策略。抗病品种‘BRS Imperial’虽已培育成功，但其市场接受度不及‘Pérola’。将二者杂交获得的分离群体兼具抗病性与优良农艺性状的互补潜力，是研究抗性机制和选育抗病材料的理想资源。
目前，针对菠萝-F. guttiforme病理体系已有基于幼苗和离体叶片的接种方法报道，但不同组织评估在同一分离群体中检测和量化基因型变异的能力尚缺乏系统比较验证。本研究旨在评估两种接种与表型鉴定程序——离体D叶接种法和茎干直接接种法——在‘Pérola’בBRS Imperial’杂交分离群体中检测基因型变异的能力，评价两种程序所得性状间的一致性，并筛选可用于后续抗性验证的候选基因型。
二、主要技术方法
研究材料包括73份分离群体个体以及亲本‘Pérola’和‘BRS Imperial’作为共同对照，采用增广区组设计，设3个区组，单株小区。离体D叶接种法：待D叶长约40cm时采集，经表面消毒后标准化为约20cm片段，用携带菌丝的无菌木质牙签在非叶绿素与叶绿素组织交界处进行浅层穿刺接种，于接种后7、14、21和30天拍照并用ImageJ软件测定病斑面积，计算最大病斑面积和病情进展曲线下面积。茎干直接接种法：制备浓度为1×104个分生孢子/mL的孢子悬浮液，在植株基部茎干用带深度限制器的金属针穿刺约5mm深，立即注入5mL孢子悬浮液，接种后120天破坏性取样，纵切茎干暴露内部病斑，拍照后用ImageJ测定两半切面的平均病斑面积。统计分析采用线性混合模型和REML/BLUP方法，通过似然比检验评估基因型和区组效应的显著性，估算方差组分和基因型决定系数，采用Spearman秩相关分析评估性状间一致性，并根据茎干病斑面积的调整基因型值筛选候选材料。
三、研究结果
3.1 两种程序检测基因型变异的能力
离差分析显示，最大叶部病斑面积、叶部AUDPC和茎干病斑面积三个性状的基因型效应均达到极显著水平，说明两种接种程序均能有效检测分离群体中的基因型变异。区组效应均不显著，其对表型方差的相对贡献仅为1%~5%。方差组分估算表明，茎干病斑面积的基因型决定系数为0.67，远高于叶部性状的0.31，同时残差比例更低，表明在本试验条件下茎干接种对分离个体具有更强的遗传区分能力。
3.2 两种表型鉴定程序间的一致性与一致性
最大叶部病斑面积与叶部AUDPC呈高度正相关，说明这两个叶部性状提供的信息在很大程度上是冗余的。然而，茎干病斑面积与最大叶部病斑面积及叶部AUDPC均无显著关联。这表明，尽管两种接种程序都能检测到显著的基因型变异，但它们在不同组织间产生的基因型排序并不一致。结合茎干病斑面积更高的基因型决定系数，研究人员认为离体叶片接种和茎干接种不能互相替代，可能捕获了菠萝对F. guttiforme抗性的不同组成部分。
3.3 基因型值预测与候选材料筛选
基于茎干病斑面积的预测基因型效应在分离个体间呈现广泛变异。73份个体中，54.8%具有负向基因型效应，即预测病斑面积低于总体均值。与亲本比较发现，41.1%的个体调整基因型值低于感病亲本‘Pérola’，其中27份介于‘Pérola’和‘BRS Imperial’之间。IBP2_70、IBP2_24和IBP1_3三个个体的调整基因型值甚至低于抗病品种‘BRS Imperial’，被认定为有前景的候选材料，需进一步验证。
四、讨论与结论
讨论部分指出，两种程序均能检测基因型变异，这与前人从同一杂交组合后代中观察到抗性分离的结果一致。方差组分差异表明茎干接种在本试验条件下具有更强的区分能力，但这不应理解为茎干接种普遍优于离体叶片接种，因为后者在时间、成本和通量方面可能更具优势，两者服务于不同的育种目标。最大叶部病斑面积与AUDPC的高度相关性提示可减少叶片评估次数，但目前尚不能确定单一评估时间点能否保持与AUDPC一致的基因型排序。两种程序间的低一致性反映了不同组织特异性反应，可能与接种物类型和用量差异有关，也与前人发现的基因型-分离株互作现象相呼应。IBP2_70等三个候选材料的识别与前期研究一致，但鉴于每份个体仅有一株重复且仅使用了单一分离株，其抗性还需通过克隆繁殖、增加重复和使用遗传多样性更高的分离株加以确认。
研究结论：两种接种程序均可检测分离群体对F. guttiforme反应的基因型变异。最大叶部病斑面积与叶部AUDPC高度一致，但叶部性状与茎干病斑面积无关联，不能作为内部植株反应的预测指标。在本试验条件下，两种表型鉴定程序均有效，茎干病斑面积对分离个体的区分能力强于离体叶片性状。IBP2_70、IBP2_24和IBP1_3被认定为有前景的后续选择阶段候选材料。这些候选材料是否确认为抗病类型，还需通过克隆繁殖植株、增加重复和使用不同F. guttiforme分离株进行进一步验证。
