《Brain Research Bulletin》：Alpk1 activates JAK2/STAT3 signaling to enhance M1-microglial activation in epileptic rats
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研究人员分析了人类颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy, TLE）相关的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据集（GSE190452），并利用毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态（statu
研究人员分析了人类颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy, TLE）相关的单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq）数据集（GSE190452），并利用毛果芸香碱诱导的癫痫持续状态（status epilepticus, SE）大鼠模型、海人酸（kainic acid, KA）处理的原代小胶质细胞和BV2细胞进行验证。结果显示，ALPK1在癫痫模型的小胶质细胞中过表达；敲低Alpk1可减轻癫痫大鼠的发作症状；敲低Alpk1可抑制M1型小胶质细胞活化及其介导的神经炎症；这些效应是通过抑制JAK2/STAT3信号通路实现的。
研究背景、问题与目的
癫痫是一种以脑神经元过度同步放电为特征的常见神经系统疾病，全球患病人数众多。其发病机制涉及免疫炎症、能量代谢紊乱、谷氨酸兴奋毒性、离子通道异常和钙稳态失衡等，但仍未完全阐明。现有抗癫痫治疗主要控制发作，难以改变癫痫发生的病理过程。小胶质细胞是中枢神经系统中重要的免疫调节和炎症介导细胞，在病理刺激下可极化为经典活化型（M1）和替代活化型（M2）。M1型小胶质细胞释放白细胞介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）等促炎因子，触发炎症级联反应并导致神经元损伤，因此调节M1极化被认为是减少癫痫发生和促进神经修复的潜在治疗策略。α-激酶1（Alpha kinase 1, ALPK1）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，也是模式识别受体（pattern recognition receptor, PRR），参与固有免疫激活，并与颞下颌关节骨关节炎、糖尿病及其相关并发症等多种免疫相关疾病有关。在神经炎症领域，ALPK1可通过NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）/Caspase-1/Gasdermin D（GSDMD）、核因子κB（NF-κB）及Janus激酶2（JAK2）/信号转导与转录激活因子3（STAT3）等通路驱动小胶质细胞焦亡和脑缺血损伤，但其在癫痫中的表达和作用尚不清楚。基于此，研究人员首次在癫痫模型及癫痫发生过程中探讨ALPK1的表达、对M1型小胶质细胞活化和神经炎症的影响及其机制。
方法概要
研究人员使用的人源样本为GEO数据库GSE190452数据集（含4例TLE患者和4例非癫痫对照）进行scRNA-seq分析；动物实验采用8–10周龄雄性SD大鼠，随机分为Sham、Model、KD-Con和KD-Alpk1四组（每组15只），通过腹腔注射毛果芸香碱建立SE模型，并在造模前7天向海马内注射携带Alpk1 shRNA或对照的腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）实现敲低；离体实验取P1–P2 SD大鼠原代小胶质细胞和BV2细胞，转染siRNA或Stat3过表达质粒后以KA刺激。主要技术方法包括scRNA-seq、基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）、Western blot、免疫组化（immunohistochemistry, IHC）、H&E染色、Nissl染色和免疫荧光（immunofluorescence, IF）。
研究结果
3.1 ALPK1在癫痫小胶质细胞中过表达
通过对GSE190452数据集进行细胞聚类分析，研究人员发现ALPK1主要表达于小胶质细胞，且TLE患者小胶质细胞中ALPK1的表达显著高于非癫痫对照。在毛果芸香碱诱导的SE大鼠模型中，qRT-PCR、Western blot和IHC结果均显示海马组织中ALPK1表达显著升高，并伴有小胶质细胞标志物IBA1表达上调。
3.2 敲低Alpk1减轻癫痫大鼠症状
研究人员在造模前通过海马内注射AAV-delivered Alpk1 shRNA实现Alpk1敲低。Western blot证实KD-Alpk1组ALPK1表达较KD-Con组显著下降。H&E和Nissl染色显示，敲低Alpk1可明显减轻海马CA1区细胞排列紊乱、细胞间隙增宽、空泡化、核固缩以及尼氏体丢失等病理损伤。行为学观察显示，KD-Alpk1组的Racine评分、每日癫痫发作频率和每日发作持续时间均较KD-Con组显著降低。
3.3 敲低Alpk1抑制癫痫大鼠M1型小胶质细胞活化
Western blot结果显示，模型组海马组织中IBA1和诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）表达上调，而敲低Alpk1可显著下调两者。qRT-PCR和Western blot进一步表明，Alpk1敲低可显著降低TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA及蛋白水平，提示敲低Alpk1可抑制M1型小胶质细胞活化并减轻神经炎症。
3.4 敲低Alpk1在体外抑制M1型小胶质细胞活化
在原代小胶质细胞和BV2细胞中，KA刺激可增加IBA1和iNOS的免疫荧光强度及蛋白表达，而转染Alpk1 siRNA可显著逆转KA诱导的上述改变，表明Alpk1敲低在体外同样抑制M1型小胶质细胞活化。
3.5 敲低Alpk1下调小胶质细胞炎症因子
qRT-PCR和Western blot结果显示，KA刺激可上调原代小胶质细胞和BV2细胞中Tnf、Il1b、Il6的mRNA水平及TNF-α、IL-1β、IL-6的蛋白表达；与Scramble组相比，Alpk1 siRNA可显著下调这些促炎因子的表达。
3.6 Alpk1激活小胶质细胞JAK2/STAT3信号
GSEA分析显示，JAK/STAT3信号通路在KEGG和Hallmark富集分析中均显著富集，提示其为ALPK1可能的下游通路。Western blot结果表明，KA刺激可促进JAK2和STAT3磷酸化，而Alpk1 siRNA可抑制KA诱导的JAK2和STAT3磷酸化，说明Alpk1敲低可抑制JAK2/STAT3信号通路激活。
3.7 Stat3过表达逆转Alpk1敲低的作用
在BV2细胞中共转染Alpk1 siRNA和Stat3过表达质粒的挽救实验中，Stat3过表达可显著逆转Alpk1 siRNA对IBA1和iNOS表达的抑制作用，并可显著逆转Alpk1 siRNA对Tnf、Il1b和Il6表达的抑制作用，进一步证实JAK2/STAT3通路介导了ALPK1促进M1型小胶质细胞活化的效应。
讨论与结论
讨论部分指出，癫痫的发生涉及代谢、免疫和炎症等多种因素，现有抗癫痫药物主要控制发作而不能改变癫痫的病理进程。多项PRR在癫痫中显著上调，ALPK1作为PRR家族成员在癫痫中高表达且广泛分布于小胶质细胞，提示其参与癫痫相关小胶质细胞病理改变。既往研究已表明ALPK1可促进巨噬细胞M1极化，并在缺血性脑损伤中激活小胶质细胞和神经炎症，本研究进一步证实敲低Alpk1在癫痫模型中可抑制M1型小胶质细胞极化和神经炎症。ALPK1还可激活JAK2/STAT3通路，该通路已知在癫痫中介导小胶质细胞活化和神经炎症。研究局限性包括未系统检测M2型小胶质细胞极化标志物（如Arg-1、CD206）和抗炎细胞因子（如IL-10），也未直接检测Alpk1敲低对神经元、星形胶质细胞等其他细胞类型的作用；Alpk1是否调控M1向M2表型转换以及是否直接保护神经元，仍需借助细胞类型特异性条件敲除模型进一步研究。
总之，本研究表明ALPK1在癫痫中高表达；敲低Alpk1具有抗癫痫作用，并有效抑制M1型小胶质细胞活化所诱导的炎症；JAK2/STAT3通路可能是介导Alpk1促癫痫效应的重要机制。该研究为理解ALPK1在神经炎症性疾病中的作用提供了新证据，也为癫痫治疗提供了潜在分子靶点。
