河口贝类香港牡蛎（Crassostrea hongkongensis）在盐度胁迫下鳃部的主动离子转运：典型离子转运蛋白NKAα、NKCC1和NHE3同源物的分子证据

《Comparative Biochemistry and Physiology Part A: Molecular & Integrative Physiology》：Active ion transport in the gill of the estuarine bivalve Crassostrea hongkongensis under salinity stress: molecular evidence from homologs of typical ion transporters NKAα, NKCC1 and NHE3

　　

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  牡蛎鳃中的关键离子转运体缺乏典型的簇特异性表达。
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  典型离子转运体的膜分布与现有模型不同。
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  NKAα 驱动牡蛎鳃中的 Cl^? 吸收，而 NKCC1 介导 Cl^? 分泌。

引言

渗透调节是水生动物在环境盐度波动下维持内部稳态的基本生理过程。在大多数水生动物中，鳃是主要的渗透调节器官，其中离子通过细胞膜的主动转运被认为是对抗离子梯度的有效策略（Hiroi and McCormick, 2012; Breves and Shaughnessy, 2024）。专门的上皮细胞，即线粒体丰富细胞（MRCs）或离子细胞，高浓度表达离子转运蛋白，根据当前盐度环境共同实现高效的离子分泌或吸收（Kovac and Goss, 2024）。因此，了解这些转运体在细胞和亚细胞水平上的组织方式，对于破译支撑水生动物盐度适应的基于离子细胞的转运系统至关重要。

自20世纪60年代以来，针对 Na⁺/K⁺-ATPase α亚基（NKAα）的抗体一直作为识别硬骨鱼类离子细胞的可靠标记物，与其他关键转运体抗体的组合极大地加速了离子转运模型的发展。一个广泛引用的模型源自莫桑比克鲈（Oreochromis mossambicus），在成体鳃中鉴定出四种不同的离子细胞类型：I型（缺乏离子转运体的未成熟细胞）、II型（具有顶端 Na⁺-Cl^? 共转运体（NCC）的离子吸收细胞）、III型（具有顶端 Na⁺/H⁺ 交换体3（NHE3）以及基底外侧 Na⁺/K⁺/2Cl^? 共转运体1（NKCC1）和 NKA 的离子吸收细胞）和IV型（具有基底外侧 NKCC 的离子分泌细胞）（Choi et al., 2011; Hiroi and McCormick, 2012）。在青鳉（Oryzias latipes）中，淡水驯化个体表现出三种不同的离子细胞亚型：NHE3 细胞（顶端 NHE3 与基底外侧 NKCC/NKA/阴离子交换体）用于 Na⁺ 吸收和酸碱平衡，NCC 细胞（顶端 NCC 与基底外侧 H⁺-ATPase）用于 Na⁺ 和 Cl^? 吸收，以及 ECaC 细胞（顶端 Ca²⁺ 通道）用于 Ca²⁺ 吸收；而海水驯化青鳉只有一种主要的离子细胞类型（顶端囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）/NHE3 与基底外侧 NKCC/NKA），介导 NaCl 分泌（Hsu et al., 2014）。这些研究为探索硬骨鱼类的基于离子细胞的转运系统提供了有价值的参考。基于这些进展，单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）已成为进一步探索的有力方法，特别是在基础知识仍然稀缺的物种中。例如，在广盐性四指马鲅（Eleutheronema tetradactylum）中，scRNA-seq 解析了16种不同的鳃细胞类型，并首次将该物种的离子细胞分为四个潜在功能亚群（Ma and Wang, 2024）。总体而言，硬骨鱼类拥有坚实的研究基础，生物信息学分析的整合对于推进我们对其基于离子细胞的转运系统的理解具有巨大潜力。

然而，无脊椎动物中的同源转运体不一定执行与硬骨鱼类相同的功能或采用相同的细胞结构，因为在后口动物和冠轮动物之间的深层系统发育距离下，序列保守性并不等同于功能保守性。事实上，关于离子转运机制的研究在海洋无脊椎动物中仍然相对有限，其中大多数是渗透调节者。甲壳类动物在鳃中可能拥有多样且复杂的离子转运系统，因为跨分类群的预测模型存在高度变异性。例如，在某些广盐性甲壳类动物中，顶端 NKCC 被认为利用向内的 Na⁺ 梯度驱动 NaCl 吸收（McNamara and Faria, 2012），但在某些物种中，NKCC 参与盐分的吸收和分泌，这取决于渗透胁迫类型（Maraschi et al., 2021）。对双壳类动物的关注较少，这是另一类主要的渗透调节者，少数研究提出了基于离子细胞的转运系统，但尚未建立综合功能模型。Nogueira et al.（2013）从 Lasmigona costata 和 Mesodesma mactroides 的鳃中分离出具有高 NKA 活性的 MRCs，为双壳类动物中潜在的基于离子细胞的转运系统提供了细胞证据。其他研究初步探索了双壳类动物在盐度胁迫下的离子转运，主要基于生理和转录分析。例如，在低盐胁迫下的 Mercenaria mercenaria 中观察到 NKA 活性初始增加，似乎可对抗鳃中 Na⁺ 和 Cl^? 的丢失，代表了一种对抗被动扩散的潜在补偿机制（Zhou et al., 2022）。相比之下，对菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）的研究表明，NKA 活性与离子（Na⁺、K⁺、Cl^?）浓度在盐度胁迫下呈正相关，两者在低盐度下均降低，在高盐度下均升高，这一模式与 M. mercenaria 中观察到的相反（Zhou et al., 2022; Liu et al., 2024）。随后的转录组分析也表明了离子转运体在 R. philippinarum 对盐度胁迫响应中的作用（Liu et al., 2024），然而，这些转运体的具体功能——是防止环境离子的过量流入还是促进主动吸收/分泌——仍然不清楚。

Crassostrea hongkongensis 是一种典型的广盐性双壳类动物，栖息于河口潮间带，由于其对盐度大幅波动的显著耐受性，成为研究渗透调节型海洋无脊椎动物渗透调节机制的优秀模型（Xiao et al., 2018; Song et al., 2023; Ibrahim et al., 2023）。先前的电镜观察在鳃中鉴定出类似离子细胞的细胞（Yue et al., 2024），且多项转录组分析表明了离子转运体参与对盐度胁迫的响应（Xiao et al., 2018; Ibrahim et al., 2023; Yang et al., 2025）。这些发现促使我们阐明牡蛎鳃在渗透胁迫下主动离子转运的机制。在本研究中，采用 scRNA-seq 构建了牡蛎鳃的转录组图谱，从而能够在单细胞分辨率下筛选和分析典型离子转运体基因的表达。NKAα、NKCC1 和 NHE3 的同源基因被选作进一步表征的对象。利用实时定量 PCR（RT-qPCR）、RNA 荧光原位杂交（RNA-FISH）、Western 印迹（WB）和多色免疫荧光，在转录和蛋白水平上研究了它们的表达模式和亚细胞定位。此外，采用 RNA 干扰（RNAi）评估了这些转运体对离子转运的功能贡献。结果揭示了这种广盐性双壳类动物中一种未被识别的离子转运策略，从根本上不同于硬骨鱼类范式，为海洋无脊椎动物的渗透调节机制提供了新的见解。

章节摘要

scRNA-seq

对于 scRNA-seq，从广东省湛江市一家牡蛎养殖场（盐度15-22）收集牡蛎（壳长：76.15 ± 3.42 mm）。在盐度18处驯化一周后，随机选取三只牡蛎，解剖其鳃并立即进行单细胞分离。鳃组织用冰 PBS 冲洗，切碎，并酶消化以获得单细胞悬液。使用 Countess? II 自动细胞计数仪通过台盼蓝排除法评估细胞活力。

scRNA-seq 揭示的鳃组织中典型离子转运体的分布和表达景观

进行 scRNA-seq 以建立 C. hongkongensis 鳃的全面细胞图谱，作为后续典型离子转运体基因表达研究的基础。原始数据可在 GenBank 中以登录号 SRR38672948 获取。质量过滤后保留了12,218个细胞，检测到33,893个基因，中位数为每细胞1070个基因和1975个 UMI 计数。线粒体百分比的中位数为9.94%。双细胞估计为

讨论

水生动物的鳃是渗透调节的主要部位，其中离子细胞协调离子转运。包括离子细胞及其膜上离子转运体在内的基于离子细胞的转运系统已在广盐性硬骨鱼类中得到广泛表征（Hiroi and McCormick, 2012; Kovac and Goss, 2024）。海洋双壳类动物是典型的渗透调节者，这些动物中基于离子细胞的转运系统的存在和功能意义一直未得到充分认识。

结论

在本研究中，我们调查了三个典型离子转运体 CHNKAα、CHNKCC1 和 CHNHE3 在广盐性双壳类动物 C. hongkongensis 鳃中的作用，为盐度诱导的离子含量调节中的主动转运提供了直接证据。scRNA-seq 和 RNA-FISH 揭示了这些转运体在鳃上皮细胞中广泛表达，而不具有硬骨鱼类中高度特化的离子细胞亚型系统所定义的簇特异性富集。在变化的盐度下，

CRediT 作者贡献声明

Qiong Yang：撰写–原稿、方法学、数据整理、概念构思。Yiting Ran：撰写–原稿、方法学、调查、数据整理。Chenyang Yue：撰写–审阅与编辑、方法学、资助获取、数据整理、概念构思。Wengang Lü：撰写–审阅与编辑。Salifu Ibrahim：撰写–审阅与编辑。Yuewen Deng：撰写–审阅与编辑、监督、资助获取。Qi Li：撰写–审阅与编辑、监督。

伦理声明

本研究按照以下动物福利和/或报告指南进行：广东海洋大学动物研究与伦理委员会指南。本研究获得了广东海洋大学动物研究与伦理委员会的批准。

利益冲突声明

本文投稿不存在利益冲突，所有作者均批准本文发表。

致谢

本研究得到以下资助：国家自然科学基金委员会（42406093）、广东省基础与应用基础研究基金（2022A1515110002）、南中国海经济动物种质创新与利用创新团队（2021KCXTD026）以及广东海洋大学科研启动基金计划（060302022105）。

Qiong Yang|Yiting Ran|Chenyang Yue|Wengang Lü|Salifu Ibrahim|Yuewen Deng|Qi Li