非模式濒危鱼类物种蛋白质组学研究：温度胁迫与原位实验中的应用

《Environmental Pollution》：Proteomic development in a non-model endangered species of fish: application under temperature stress and in situ experiments

　　

一份在非模式濒危物种中鉴定的2980种蛋白质目录
使用MRM模式靶向质谱监测所选蛋白质
研究在不同温度暴露后蛋白质的变化
受污染河流暴露对蛋白质丰度的影响
引言
化学污染目前被认为是生物多样性丧失的主要驱动因素之一，特别是在水生生态系统中，它们作为农药、金属、药物和工业化合物等多种污染物的汇（H?der et al., 2020; Schwarzenbach et al., 2006）。最近的估计显示，在过去的几十年中，56%的海洋物种和高达85%的淡水动物物种遭受了种群数量损失（WWF, 2024）。在已确定的生物多样性丧失主要驱动因素中（即栖息地丧失、入侵物种、气候变化、过度开发和污染），它们各自的作用和相互关系仍然不清楚，尤其是关于化学污染的作用（Bernhardt et al., 2017; Hooper et al., 2013; Sylvester et al., 2023）。
为了评估欧洲水环境的质量，水框架指令（WFD）规定必须监测欧盟成员国的生态状态和化学状态（European Commission, 2000）。具体而言，WFD要求对水中、沉积物和生物体中常规更新的优先化合物清单进行监测（Council of the European Union, 2025; European Commission, 2013）。然而，由于存在大量多样化的污染物，要对其在水生生态系统中的存在进行全面研究具有挑战性。由于效应取决于暴露条件、生物有效性和物种敏感性（在非模式物种中尚不清楚），仅靠化学监测无法提供污染物对水生生物生物学效应的直接信息（Brack et al., 2016; Milinkovitch et al., 2019; Noguera-Oviedo and Aga, 2016）。在此背景下，通过生物监测方法直接测量在环境中暴露的生物体反应，提供了一种更具整合性的方法，考虑了混合效应和生物有效性（Cedergreen, 2014; van der Oost et al., 2003）。其中，分子反应可以提供对环境污染暴露及其效应的敏感早期指标。因此，它们是研究污染物对水生生物影响的宝贵工具（van der Oost et al., 2003; Yu et al., 2022）。蛋白质调节在生态毒理学研究中尤为引人关注，因为它们整合了所有转录后调控机制，并被认为是细胞功能的可靠指标（Garcia-Reyero and Perkins, 2011; Liang et al., 2020）。蛋白质组学的应用已被证明对于研究水生生物对环境污染的复杂分子反应特别相关（Gouveia et al., 2019; Zhang et al., 2018）。特别是，多反应监测（MRM）模式下的靶向质谱（MS）代表了一种非常有效的方法，因为它能够精确地同时定量大量蛋白质，并且具有高度的选择性和敏感性，所需的生物材料量很小，同时限制了测试动物的数量（Faugere et al., 2020; Gouveia et al., 2019; Kulyyassov et al., 2021; Leprêtre et al., 2022, 2023a; Liebler and Zimmerman, 2013）。
然而，大多数分子工具是在模式物种上开发的，它们在实验室应用中得到了广泛研究，从而提供了详细的分子资源（包括基因组序列）以及关于其对污染反应的详细知识（Armengaud et al., 2014; Leonelli and Ankeny, 2013）。开发生物毒性机制研究分子指标的一个主要挑战在于，许多野生动物非模式物种缺乏基因组和分子生理学方面的了解，例如有注释的基因组和/或蛋白质组（Armengaud et al., 2014; Gouveia et al., 2019）。最近一代测序技术的进展和基因组的丰富化，使得开发新的蛋白质发现方法成为可能，例如意蛋白基因组学，它整合了蛋白质组学和转录组学或基因组学数据（Leprêtre et al., 2025; Levin and Butter, 2022; Nesvizhskii, 2014）。蛋白基因组学由蛋白质 shotgun MS 分析和核酸测序相结合组成，旨在基于物种特异性参考转录组的使用，为每种感兴趣的物种获取一份经实验验证的蛋白质综合目录（Nesvizhskii, 2014）。这种方法特别有价值，因为它可以帮助识别众多物种的新分子指标，而无需完整的基因组或蛋白质组注释（Armengaud et al., 2014）。例如，先驱研究调查了 Gammarus fossarum 的雌性生殖组织蛋白质组（Trapp et al., 2016）和 Dreissena polymorpha 的免疫蛋白质组（Leprêtre et al., 2019）。最近，对三种哨兵物种（G. fossarum、D. polymorpha 和 Palaemon serratus，它们仍然没有已测序的基因组）的蛋白质组在器官水平上进行了探索（Leprêtre et al., 2023b）。这些技术进步使得能够识别参与生殖系统和代谢途径的相关蛋白质（例如能量分配、脂肪酸降解和渗透调节或谷胱甘肽代谢）（Degli Esposti et al., 2019; Koenig et al., 2024），并调查污染物对与 G. fossarum 生理功能相关的蛋白质的影响（Koenig et al., 2021）。最后，一个整合蛋白基因组学和靶向 MRM 的流程已被提出作为在非模式物种中开发环境相关生物标志物的方法（Faugere et al., 2020; Gouveia et al., 2019）。
在此背景下，本研究旨在在一个非模式濒危物种，即欧鳇（Alosa alosa）中发现与生物适应性相关并参与对污染反应的蛋白质。欧鳇是一种洄游性鱼类物种，在春季沿河上溯至产卵场繁殖（Acolas et al., 2004; Belaud et al., 2001; Boisneau, 1990）。尽管曾经在大西洋北海岸沿岸数量众多，但其种群数量在过去二十年中有所减少（Limburg and Waldman, 2009）。这种情况在加龙河流域（法国西南部）尤为明显，其种群丰度在2000年代初急剧下降，并一直维持低水平（Baglinière et al., 2003; Rougier et al., 2012）。一些研究表明，产卵场的水质可能影响欧鳇早期生命阶段的发育。风险评估评估显示，化学污染可能对法国西南部的鱼类构成毒性风险，其中发育早期阶段特别容易受到影响（Bellier et al., 2024）。我们最近的研究提供了补充证据，显示通过将欧鳇早期生命阶段原位暴露于加龙河位于产卵场的一个地点的河水中，导致了很高的胚胎死亡率（Bancel et al., 2025）。在该研究中，观察到在河水中暴露期间有明显的胚胎死亡。然而，与对照组相比，原位暴露结束时在个体幼虫标志物上仅观察到有限的影响（幼虫长度、畸形或幼虫存活率）。
本研究的具体贡献是首次在濒危非模式洄游鱼类物种中发现并使用结合靶向 MRM 蛋白质组学的蛋白基因组学流程，为未来研究种群健康提供分子工具，以检测对环境污染的早期反应并调查可能参与种群减少的机制。使用蛋白基因组学方法对欧鳇幼虫的蛋白质组进行了表征，允许建立一个大规模物种特异性蛋白质目录。在本研究中，选择了特定蛋白质作为适应性和幼虫发育指标，其他蛋白质作为鱼类防御组的一部分（Eide et al., 2021）。开发了一种靶向 MRM 蛋白质组学方法来定量它们。采用了两个互补实验来研究这些蛋白质在欧鳇幼虫中的反应。首先，使用基于实验室的方法来调查孵化温度作为发育调节变量对所选与适应性和应激防御相关的蛋白质丰度的影响。其次，在幼虫整个卵裂胚胎发育期间暴露于加龙河河水的情况下监测这些蛋白质，以确定适应性和化学应激相关蛋白质是否与由水质差引起的孵化和幼虫损伤相关。河水暴露通过受控条件（温度和充氧）下的原位野外实验室进行，但河水暴露是连续的（实验装置和存活结果详见 Bancel et al., 2025）。
章节片段
实验程序
欧鳇胚胎由 MIGADO 地区非政府组织在迁徙期间通过鱼陷阱在 Golfech 水闸捕获的野生亲鱼中获取，作为莱茵河物种重新引入计划的一部分（EU LIFE 项目，Hundt et al. (2015), Scharbert et al. (2011), https://static-lanuk.nrw.de/alosa-alosa/en/index.html）。在运输到水产养殖设施后，亲鱼被注射 LHRH（黄体激素释放激素）以诱导繁殖。然后，雄性和雌性...
不同温度下实验室和野外暴露中的胚胎幼虫发育
实验结束时（2日龄幼虫时的存活幼虫百分比）的幼虫存活率随温度变化而变化，在20°C时观察到最高存活率（62.7 ± 6.4%），而在较冷（14°C时为42.3 ± 11.5%）和较温暖（26°C时为35.7 ± 13.4%）的暴露温度下存活率较低（比较20°C与14和26°C时最终幼虫数量时p值 < 0.05）（表1）。直到孵化的发育持续时间随温度升高而减少，平均为9.3 ± 0.0...
讨论
本研究的目的旨在探索蛋白质组学工具在野外非模式物种，即欧鳇中的应用，以在法国西南部种群减少的背景下研究早期分子反应。
结论
在本研究中，我们产生了一份来自非模式濒危硬骨鱼类物种，即欧鳇（Alosa alosa）幼虫阶段的物种特异性蛋白基因组学资源。我们利用该资源开发了一种定量与适应性和应激防御相关蛋白质的靶向蛋白质组学方法。最近，据显示，一个产卵场附近的水质导致了很高的胚胎死亡率，这令人对化学污染对该物种减少的影响产生疑问。我们观察到差异...
CRediT作者贡献声明
Jean Armengaud：撰写 – 审阅与编辑，概念化。Arnaud Salvador：撰写 – 审阅与编辑，概念化。Maud Pierre：撰写 – 审阅与编辑，调查，形式分析。Kevin Sugier：撰写 – 审阅与编辑，调查。Davide Degli Esposti：撰写 – 审阅与编辑，调查，资金获取，概念化。Anabelle Espeyte：撰写 – 原稿，调查，形式分析，概念化。Jean-Charles Gaillard：撰写 – 审阅与...
未引用参考
Council of the European Union, 2025.
利益冲突声明
? 作者声明没有已知的可能影响本文所述工作的竞争财务利益或个人关系。
致谢与资金
作者感谢 MIGADO 协会为本研究提供生物材料，EDF 提供设施，Genotoul（INRAE）提供 RNAseq 文库构建和测序的主机支持。本工作还得到了 XPO 科学基础设施（INRAE, AnaEE, France）单位的支持。本工作受益于法国 GDR "水生生态毒理学"框架，该框架旨在促进具有刺激性的科学讨论和合作，以实现更具整合性的方法。我们还感谢...
Sarah Bancel|Anabelle Espeyte|Jean-Charles Gaillard|Jér?me Cachot|Arnaud Chaumot|Marion Blaya|Maud Pierre|Kevin Sugier|Jean Armengaud|Arnaud Salvador|Eric Rochard|Olivier Geffard|Davide Degli Esposti