磷酸化导致PER3不稳定，从而促进胆囊癌

《Experimental Cell Research》：Phosphorylation destabilizes Per3 to promote gallbladder carcinoma

　　

1. Per3通过结合P4HA1并抑制TGFB1/TGFBI转录，抑制HIF-1α/糖酵解和TGF-β/EMT通路，从而抑制胆囊癌（GBC）的进展。
2. CK2介导的S1048磷酸化招募STUB1，促进Per3的泛素化和降解。
3. Per3低表达与不良预后相关，CK2-STUB1-PER3轴代表了GBC中潜在的治疗靶点。

**引言**

昼夜节律是一种进化保守的机制，调节多种生物和生理过程。大多数生理活动遵循昼夜节律。许多研究表明，昼夜节律的成分形成负反馈回路。哺乳动物的昼夜节律是细胞自主的，涉及一个转录反馈回路，其中核心转录激活因子BMAL1与CLOCK或NPAS2形成二聚体，激活时钟和时钟相关基因的转录，如PERIOD1-3和CRY1-2。随后，PERs与CRYs形成二聚体，节律性地抑制CLOCK:BMAL1介导的转录。大约5-15%的转录本受到节律性调节。

PERIOD是第一个被鉴定的时钟基因，具有三个亚型，包括PER1、PER2和PER3，它们具有相似的结构，在昼夜节律、睡眠稳态、细胞增殖和肿瘤进展中发挥重要作用。最近一篇关于昼夜节律紊乱与癌症风险之间联系的大样本流行病学和机制研究的综述提供了流行病学证据，表明昼夜节律紊乱正成为癌症的一个关键风险因素。由于褪黑素抑制、CLOCK和BMAL1基因表达异常、自然杀伤细胞活性降低以及代谢失衡导致的慢性炎症等昼夜节律紊乱，与包括乳腺癌、前列腺癌和其他癌症在内的肿瘤进展密切相关。夜间光照暴露和长期轮班工作已被确定为癌症发病的主要风险因素。更多研究表明Per1和Per2作为转录抑制因子，而Per3的作用仍不清楚。与Per1和Per2在肿瘤中已被充分阐明的作用一致，关于Per3的了解尚不充分。几项研究提出了Per1在肿瘤细胞凋亡中的相反作用。Per1通过抑制糖酵解抑制口腔鳞状细胞癌的生长。在临床上，Per3下调在人类前列腺癌中被发现，并作为前列腺癌的预后指标。Per3通过调节BMAL1表达介导Wnt/β-catenin通路的激活。虽然目前直接联系昼夜节律紊乱与胆囊癌的流行病学证据有限，但一项大型前瞻性队列研究（n≈383,000）报道了轮班工作与肝外胆管癌之间的关联（HR=1.83，95% CI: 0.96-3.51），尽管GBC病例太少无法单独分析。针对胆道癌，最近一项研究的临床证据表明，包括BMAL1、PER2和NR1D1在内的核心时钟基因调节恶性表型和吉西他滨敏感性。此外，另一项研究揭示了一个新的BMAL1/HIF1/NANOG轴负责GBC的干性。

已鉴定出200多种不同的蛋白质翻译后修饰。磷酸化是一种重要的蛋白质翻译后修饰，主要发生在丝氨酸（84%）、苏氨酸（15%）和酪氨酸（<1%）残基上。随后，在约30%的真核生物蛋白质中鉴定出了大量磷酸化位点，人类基因组中约2-5%的基因编码蛋白激酶和磷酸酶。磷酸化通过改变蛋白质构象、影响蛋白质之间的相互作用或促进其通过蛋白酶体的泛素化和降解来影响蛋白质稳定性。同时，磷酸化也对目标蛋白质的酶活性和细胞定位具有调节作用。几项研究报道了哺乳动物Clock-Bmal1蛋白质、果蝇Period蛋白质的磷酸化修饰，以及由CKI、CKII、GSK-3β和NEMO/NLK等蛋白激酶和PP2A（蛋白磷酸酶-2A）和PP1（蛋白磷酸酶-1）等蛋白磷酸酶调节的磷酸化/去磷酸化过程，这些过程改变了昼夜节律蛋白的稳定性和功能。Per1在S714位点的磷酸化维持了小鼠昼夜节律与能量代谢之间的一致性。CKI介导的Per1磷酸化调节其在正常人成纤维细胞中的蛋白质稳定性和核转位。然而，Per3的磷酸化尚未见报道。在本研究中，我们鉴定了Per3在S1048位点的磷酸化，并探索了其在GBC中的作用和机制。

肿瘤微环境最显著的特征是氧气扩散和消耗的动力学梯度，导致大多数实体瘤出现缺氧条件。与其他肿瘤类似，缺氧是肿瘤微环境的一个标志性特征。肿瘤对缺氧条件的适应也导致了肿瘤进展中的巨大变化，包括增殖、血管生成、代谢和免疫方面的改变。低氧诱导因子1（HIF-1）是协调细胞对低氧环境适应机制的关键因子。HIF家族有三个成员，都由一个对O2敏感的α亚基和一个对O2不敏感的β亚基以异二聚体结构组成。大多数缺氧相关基因由HIF-1a通过缺氧反应元件（HREs）调节，从而促进肿瘤进展和转移。几项研究报道了HIF-1在胆囊癌进展和化疗放疗耐药中的重要作用。肿瘤微环境（TME）的一个定义性特征是浸润了大量肿瘤相关成纤维细胞（CAFs）和免疫细胞，它们与肿瘤细胞建立复杂的网络，驱动肿瘤恶性程度、免疫逃逸和治疗耐药性。肿瘤相关成纤维细胞和免疫细胞在GBC中都发挥着广泛的作用。最近的研究还揭示了一种复杂的分子串扰，其中CAFs和GBC细胞参与双向信号级联反应，从而助长肿瘤的侵袭性。CAF来源的纤维收缩蛋白-4（TSP-4）与整合素结合，激活Akt/HSF1轴，促进GBC进展和肿瘤干细胞特性。昼夜节律基因，特别是PER3，在塑造肿瘤微环境中发挥着关键作用。PER3的表达与免疫评分、PDCD1（PD-1）、CD4+ T细胞和CD8+ T细胞密切相关，从而抑制肿瘤进展。虽然目前关于CAF中Per3表达与癌症进展之间直接联系的证据有限，但在本研究中，Per3在GBC中对HIF-1α表达和相关糖酵解代谢具有调节作用。

上皮-间充质转化（EMT）是一种进化保守的细胞过程，参与多种生理和病理条件，特别是在癌症中，它促成了癌症转移，是癌症相关死亡的主要原因。EMT过程表现出形态变化和分子改变，上皮细胞的细胞间连接被解构，上皮标志物表达降低，但细胞收缩性和间充质标志物表达增加，赋予细胞增强的迁移、侵袭和抗凋亡刺激能力，这一过程经典地由TGF-β信号通路调节，以及包括骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子受体和Notch通路在内的其他信号通路。我们的研究发现Per3在GBC中对EMT进程具有调节作用。

总之，本研究调查了Per3的S1048磷酸化及其通过调节HIF-1α/糖酵解和TGF-β/EMT通路对GBC的抑制作用，为GBC治疗提供了潜在的靶点。

**材料与方法**

**细胞培养**
人类胆囊癌GBC-SD和SGC-996细胞购自中国科学院模式生物研究国家工程研究中心（上海，中国）。人类胆囊癌SGC-996细胞由同济大学医学院杨教授的实验室提供。细胞在含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的DMEM高糖培养基中，于37°C、CO2培养箱中培养。

**抗体和试剂**
PF-670462（货号#HY-15490）、DMAT（货号#HY-15535）、TDZD-8（货号...

**Per3表达降低负责GBC的侵袭性表型和不良预后**

几项研究报道了Per3在肿瘤中的作用。为了确定Per3在GBC进展中的作用，我们首先通过实时PCR检测了20对GBC样本中Per1、Per2和Per3基因的表达水平。在胆囊癌和相邻胆囊组织之间未确定Per1、Per2和Per3的显著差异。然而，在12对GBC样本中证实了肿瘤中Per3蛋白的降低，而非Per1或Per2。

**讨论**

昼夜节律在调节多种生理和病理过程中发挥着重要作用，昼夜节律失调也在许多肿瘤中被发现。Per3是昼夜节律的核心成员。已有研究指出Per3对肿瘤的抑制作用。与相邻组织相比，GBC样本中确定的是Per3蛋白水平而非mRNA水平降低，这预示了不良预后。为探索...

**局限性与未来方向**

本研究存在若干局限性需要承认。我们在Per3表达和磷酸化分析之前未进行昼夜节律同步化，表型检测在单一时间点进行，且未包含挽救实验。这些局限性不影响我们的主要机制结论。在未来的研究中，我们计划：(1)使用地塞米松或血清冲击同步化GBC细胞；(2)在多个昼夜节律时间点检测Per3表达和磷酸化...

**作者贡献声明（CRediT）**

Tao Suo：资源。Xiaoling Ni：资源，方法论。Shuijun Li：资源，概念化。Kun Fan：写作——原稿撰写，验证，调查，资金获取，形式分析，数据整理，概念化。Shulong Zhang：验证，资源，项目管理。Xi Cheng：调查，数据整理。Houbao Liu：写作——审查与编辑，概念化。Chunyan Wang：写作——审查与编辑，数据整理，形式分析，调查。Yanlei Xin：

**伦理声明**

已从未所有参与者或其法定代理人处获得参与本研究并发布文章的书面知情同意。研究遵守了参与者的隐私权。本研究包括器官或组织捐赠者。本研究包含人体生物材料，已获得捐赠者或其直系亲属或法定代表人的同意，用于本研究及文章发表。本研究使用的样本并非来源于已执行...

**数据可用性**

数据将应要求提供。

**资金支持**

本研究受国家自然科学基金（82072682，82372832，82272772）、上海市自然科学基金（22ZR1457800）和上海徐汇区医学研究项目（SHXH202306，SHXH202508）资助。所有作者均对本研究有所贡献。

**利益冲突声明**

作者声明他们不存在已知的可能影响本文所报告工作的财务利益或个人关系。

Kun Fan | Xi Cheng | Chunyan Wang | Yanlei Xin | Sheng Shen | Jiwen Wang | Xiaojian Ni | Bohao Zheng | Han Liu | Tao Suo | Xiaoling Ni | Shuijun Li | Shulong Zhang | Houbao Liu