围产期BPA暴露相关的雄性后代抑郁样行为可能涉及自噬相关蛋白的变化及GABARAP-GABAAR相互作用

《Food and Chemical Toxicology》：Perinatal BPA Exposure-Associated Depressive-like Behaviors in Male Offspring May Involve Changes in Autophagy-Related Proteins and GABARAP-GABAAR Interaction

　　

# 围产期BPA暴露诱发雄性子代抑郁样行为

- 围产期BPA暴露诱发雄性子代抑郁样行为。
- BPA改变海马GABA、多巴胺及自噬相关蛋白。
- BPA降低齿状回中GABARAP与GABAAR的共定位。
- 3-MA加重BPA暴露雄性子代的抑郁样行为。
- 转录组学揭示GABA能及突触通路基因改变。

## 引言

双酚A（BPA）是一种广泛用于聚碳酸酯塑料和环氧树脂生产的合成有机化合物。越来越多的流行病学证据将发育期BPA暴露与儿童不良神经行为结局联系起来[1,2,3,4]。一项对29项研究的系统综述强调，产前BPA暴露与内化行为增加（包括焦虑和抑郁）持续相关——这些观察为当前啮齿类动物模型的使用提供了依据[5]。一项前瞻性出生队列研究进一步证实，孕期母体较高BPA水平预测学龄儿童执行功能和行为调节能力较差[4,6]。此外，儿童期暴露本身与多动、攻击性和抑郁增加有关[2,3,7]。这些趋同的人类发现为研究BPA所致神经行为缺陷的机制基础提供了令人信服的理由。然而，啮齿类动物行为发现向人类神经发育结局的转化相关性应谨慎解读，因为人类神经发育的时间尺度与啮齿类动物存在显著差异，且人类中焦虑和抑郁等行为构念是多维度的，不能直接从简单的啮齿类动物检测中直接外推。

双酚A（BPA）是一种高产量环境化学品，人类普遍暴露于此，主要通过饮食摄入[8]。基于生物监测的普通人群每日BPA摄入量估计在不同NHANES周期中持续报告约为25–70 ng/kg体重/天[9,10]。2023年，欧洲食品安全局（EFSA）完成了BPA风险的全面重新评估，建立了新的可耐受每日摄入量（TDI）为0.2 ng/kg bw/天——比此前临时TDI（4 μg/kg bw/天）降低了20,000倍——并得出结论认为所有年龄段人群的饮食BPA暴露超出此TDI两到三个数量级[11,12,13]。

为调查BPA在与人相关的环境暴露和升高暴露水平下对神经发育的潜在影响，本研究在围产期母鼠饮用水中使用了两种浓度的BPA（0.2 μg/mL和2.0 μg/mL）[14,15]。使用源自小鼠与人类之间BPA毒代动力学曲线下面积（AUC）比较得到的小鼠人等效剂量因子（HEDF）0.0155，这些剂量分别对应人等效剂量（HED）约为0.62和6.2 μg/kg/天[16,17,18]。低剂量HED（0.62 μg/kg/天）超出当前EFSA TDI约3,100倍，且可与之相当或高于4 μg/kg/天的此前临时TDI[19]。高剂量HED（6.2 μg/kg/天）处于啮齿类动物研究中与不良效应相关的HED范围内（0.24–8.25 μg/kg/天），且远低于美国环保署（EPA）的参考剂量（RfD）50 μg/kg/天[20,21]。重要的是，给药浓度和相应的HED代表外暴露的估计值，鉴于种属间毒代动力学和代谢的差异，不应等同于内组织暴露。总体而言，所选剂量涵盖了与环境暴露和高水平人类暴露场景相关的暴露水平，同时能够检测神经行为和分子终点的剂量依赖效应，每个剂量均有已发表文献和监管参考值支持。

海马齿状回（DG）在神经发生和情感调节中发挥关键作用[22]。在分子水平上，BPA通过对激素和突触过程的协调干扰破坏大脑发育[23,24]。其内分泌干扰特性损害雌激素、雄激素和甲状腺激素信号传导，而这些是神经发生和神经元连接的关键调节因子[25]。同时，BPA直接改变突触蛋白的组成，特别是在GABA能和谷氨酸能系统中，从而破坏正常回路功能和情绪调节所需的突触可塑性[26,27]。

自噬已被认为与抑郁症发病机制有关[28,29,30,31]。GABA A型受体相关蛋白（GABARAP）是自噬相关蛋白家族的成员，对于自噬体形成和成熟至关重要[32]。由于自噬抑制导致GABARAP表达降低，可能通过失调GABA A型受体（GABAAR）的膜转运来损害GABA能信号传导，导致导致抑郁表型的GABA能功能低下[33,34,35,36,37]。值得注意的是，BPA可通过改变关键自噬相关基因和蛋白的表达来抑制自噬[38,39,40,41,42,43,44,45]。然而，BPA所致发育中大脑自噬通路破坏与行为结局之间是否存在直接因果联系在很大程度上仍未得到探索。

为探究自噬在BPA所致神经行为缺陷中的功能参与，本研究采用了3-甲基腺嘌呤（3-MA）——一种已确立的自噬抑制剂[46]。3-MA通过腹腔注射给予，剂量为20 mg/kg/天，从出生后第14天（PND14）至PND21，这一时期对应小鼠海马发育的幼鼠阶段[47,48,49]。此剂量和方案基于先前证明可在啮齿类动物中枢神经系统中有效抑制自噬的研究选定。然而应注意，3-MA是III类PI3K的广谱抑制剂，可能影响自噬以外的细胞过程[50,51]；因此，3-MA处理观察到的效应应解释为暗示自噬参与，而非通路特异性因果关系的明确证据。

新兴证据表明，BPA的毒理学特征超出了经典内分泌干扰，包括自噬等核心细胞稳态过程的失调。BPA似乎并非简单地诱导自噬，而是破坏自噬流，通常通过内质网应激介导的通路和溶酶体损伤，导致细胞损伤和凋亡[52,53]。当暴露发生在关键发育窗口期时，此类损伤的功能后果尤为显著。此外，围产期BPA暴露已被证实与持续的性别特异性行为缺陷相关，包括雌性焦虑样行为和认知损害增加，以及雄性社交缺陷和多动增加，这可能由受损的激素编程和表观遗传修饰驱动[54,55,56,57]。然而，BPA所致发育中大脑自噬通路破坏与行为结局之间的直接因果联系在很大程度上仍未得到探索。

转录组学分析已成为解析环境毒物诱导神经毒性分子机制的有力工具。现有证据表明，毒物暴露可在大脑中诱导广泛的转录重编程，影响与突触功能、神经传递和线粒体代谢相关的基因——这些过程此前已被证明与BPA所致神经行为异常有关[58,59]。然而，围产期BPA暴露后子代海马的系统性转录组分析仍然缺乏，这限制了我们理解将BPA暴露与自噬功能障碍、GABA能系统损伤以及最终抑郁样行为联系起来的转录调控机制。

本研究的一个关键局限是仅使用雄性子代。这一先验决定基于两个主要理由。首先，限定于雄性可减少由性别依赖性激素轨迹引起的生物学变异性，从而在此初始调查中提高检测BPA所致分子和行为效应的统计功效[46,47,48]。其次，鉴于人类男性在早期生活中抑郁障碍的基线患病率较高以及BPA明确的性别特异性神经行为效应，聚焦于雄性可在扩展至更复杂的女性神经内分泌环境之前，为自噬的参与提供保守的概念验证[70,71,72,73]。然而，由于未包含雌性子代，我们的结论不能推广至所有子代。理想情况下，未来研究应纳入两种性别并正式检验性别×BPA交互作用。如果这不可行，标题、摘要和结论必须明确说明"雄性子代"，并清楚地将缺失雌性受试者确定为主要局限性。因此，本手稿中所有后续发现和解释严格限于雄性子代小鼠，不应外推至雌性或解释为代表性别无关效应。

因此，本研究旨在确定围产期BPA暴露对雄性子代小鼠抑郁样行为的影响，初步探索使用3-MA药理学抑制自噬相关通路的参与，并鉴定潜在将BPA暴露与GABA能和自噬失调联系起来的转录组特征，从而为理解BPA的神经行为效应提供一个多层框架。

## 各部分摘要

### 动物与暴露

C57BL/6小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司（北京，中国）。适应一周后，雌雄小鼠按2:1比例配对，发现阴道栓的当天定为妊娠第0天（GD0）。基于先前的研究[58,59,60,61]，共将三十只怀孕C57BL/6小鼠随机分配至三个实验组（每组n = 10只母鼠）：对照组（溶剂组，含1%的蒸馏水）、LBPA组和HBPA组。

### 围产期BPA暴露不改变母体生理学但诱发抑郁样行为并改变子代脑器官系数

妊娠和哺乳期间母鼠体重、食物摄入和饮水在不同组别间（对照组、LBPA组和HBPA组）无显著差异（图2A–C）。以体重为协变量的单因素协方差分析显示肝脏、肾脏、脾脏或脑系数在组间无显著差异（所有p>0.05）。然而，海马系数在组间存在显著差异F(2,14)=8.403，P<0.01，η2p=0.546）。校正后的边际均值分别为：对照组0.020，LBPA组0.020，HBPA组0.019。

## 讨论

本研究提示围产期BPA暴露（0.2 μg/mL，2 μg/mL；GD0-PND21）与雄性子代小鼠的抑郁样行为相关。围产期是神经系统快速发育的关键时期，BPA暴露可能干扰神经系统的正常发育[33]。例如，它可以影响神经元的分化、迁移和突触形成，导致神经系统的结构和功能异常，进而影响...

## 结论

综上所述，我们的发现提示围产期BPA暴露与雄性子代小鼠的抑郁样行为相关，伴随自噬相关蛋白改变、GABAAR和GABARAP表达降低、齿状回中GABARAP-GABAAR共定位受损以及海马GABA和多巴胺水平降低。3-MA药理学抑制加重了这些行为和神经化学缺陷，提示自噬相关通路的潜在参与。

## CRediT作者贡献声明

Liang Gao：概念化设计。
Hong Li：方法学。
Dongying Yan：方法学。
Muzi Qian：撰写——初稿。
Ying Huang：方法学。
Xiaobai Wang：方法学。
Hang He：方法学。
Weifan Kong：方法学。

## 未引用的参考文献

88.

## 数据可用性

图中所有数据均已包含在手稿中。数据可从作者处获取。

## 利益冲突

作者声明无利益冲突。

## 临床试验编号

不适用。

## 机构审查委员会声明

所有动物实验均经锦州医科大学机构动物照护和使用委员会（IACUC）审查并批准（批准号：240099）。所有操作均按照动物伦理治疗的相关指南和法规进行。

## 资金来源

本研究由辽宁省教育厅基本科学 research 项目（LJ212410160066）和辽宁省自然科学基金（2022-BS-314）资助。

## 利益冲突声明

? 作者声明不存在任何可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

## 致谢

不适用。

Muzi Qian | Hang He | Weifan Kong | Ying Huang | Xiaobai Wang | Hong Li | Dongying Yan | Liang Gao