栀子果实富集黄酮类化合物的代谢组学特征与生物合成解析：功能性食品应用前景

《Food Chemistry: Molecular Sciences》：Metabolomic profiling and biosynthetic insights into fruit-enriched flavonoids in Gardenia jasminoides: Implications for functional food applications

　　

摘要：研究人员采用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）对栀子不同组织进行代谢组学分析，结合定量实时聚合酶链式反应（qPCR）检测关键生物合成基因的表达水平，并通过分子对接模拟预测黄酮类化合物与Kelch样ECH关联蛋白1（KEAP1）的结合活性。结果显示，在栀子的茎、叶、花芽、花和果实五个组织中鉴定出70种正离子模式和46种负离子模式的黄酮类代谢物。尽管果实整体黄酮含量较低，但研究人员筛选出八种果实特异性富集的黄酮化合物，包括poncirin、isorhamnetin-3-O-rutinoside、flavaprin、5,2′-dihydroxy-7,4′-dimethoxyflavanone、4′,5,7-trimethoxyflavonol、4′,5,7-trihydroxy-3-methoxyflavone-7-O-rutinoside、vitexin 7-O-sulfate和hemsleyanoside。基因表达分析表明，分支途径基因黄酮合酶II-1（FNSII-1）和黄烷酮3-羟化酶（F3H）在果实中显著上调表达，并与这八种化合物的积累呈正相关。分子对接结果表明，两种苷元——4′,5,7-trimethoxyflavonol和5,2′-dihydroxy-7,4′-dimethoxyflavanone——与KEAP1的结合能与阳性对照木犀草素（luteolin）处于相似范围（分别为?6.87 kcal/mol和?6.72 kcal/mol，木犀草素为?6.83 kcal/mol）。这些发现揭示了栀子果实选择性富集特定黄酮类化合物的分子机制，为其作为功能性食品原料的开发提供了初步的理论依据。

一、研究背景与科学问题

栀子（Gardenia jasminoides Ellis）是东亚地区传统药食两用植物，其干燥果实广泛用作食品着色剂、茶饮和糖果调味剂以及健康饮料的功能性成分。黄酮类化合物（flavonoids）是栀子果实中重要的抗氧化活性物质，在功能性食品开发中具有潜在价值。然而，此前关于栀子化学成分的研究主要集中在果实部位，对其他组织的黄酮分布缺乏系统表征。更为关键的是，前期非靶向代谢组学数据揭示了一个矛盾现象：虽然果实是栀子的可食用部位，但大多数黄酮代谢物在叶片和茎中的丰度远高于果实，而少数几种黄酮却在果实中特异性富集。这一现象引出了一个核心科学问题：在总体黄酮含量较低的背景下，是什么驱动了某些黄酮类化合物在栀子果实中的选择性积累？

针对上述问题，本研究旨在：（i）系统表征栀子不同组织中的黄酮组织特异性分布图谱；（ii）鉴定果实富集的黄酮代谢物并重建其假定生物合成途径；（iii）确定关键生物合成基因的表达模式以定位负责果实富集调控的基因；（iv）通过分子对接（molecular docking）预测所鉴定果实富集黄酮的Kelch样ECH关联蛋白1（KEAP1）结合活性。

二、主要研究方法

研究人员采用了三种核心技术手段：首先，利用液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）对采自重庆市巴南区同一母株扦插繁殖的三株7龄克隆植株的茎、叶、花芽、花和果实五个组织进行黄酮代谢物谱分析，使用Compound Discoverer 3.3进行峰检测、对齐和过滤，并通过novoDB、京都基因与基因组百科全书（KEGG）、人类代谢组数据库（HMDB）和LIPID Maps数据库进行注释；其次，通过本地BLAST搜索比对拟南芥和水稻序列在全基因组范围内鉴定候选基因，采用定量实时聚合酶链式反应（qPCR）检测七个关键结构基因在不同组织中的表达水平，以葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）、DEAD-box解旋酶和40S核糖体蛋白S15a（40S-S15a）作为内参基因；最后，从蛋白质数据库（RCSB PDB）获取人源KEAP1 Kelch结构域的三维结构（登录号2FLU，分辨率1.90 ?），使用AutoDock 4.2软件对八种果实富集黄酮及其苷元进行分子对接模拟，以已知KEAP1结合剂木犀草素作为阳性对照。

三、研究结果

3.1 栀子组织的全局代谢判别分析

主成分分析（PCA）得分图显示五个组织沿第一主成分（PC1）明显分离，果实与营养器官和花器官显著区分。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）模型具有良好的拟合度和预测能力（R²X = 0.989，R²Y = 0.994，Q²Y = 0.882），证实了组织特异性代谢分化的稳健性。层次聚类热图进一步揭示了特定化合物在相应组织中的优先富集模式。

3.2 正离子模式下黄酮类化合物的组织分布

共注释到70种黄酮代谢物，分为六类：黄酮（flavones，42种）、黄烷酮（flavanones，16种）、黄酮醇（flavonols，6种）、查尔酮（chalcones，3种）、花青素（anthocyanidins，2种）和黄烷-3-醇（flavan-3-ols，1种）。茎和叶是黄酮的主要积累组织，果实整体黄酮多样性和相对丰度最低。研究人员以果实相对丰度至少为其他组织两倍为标准，筛选出四种果实富集黄酮：poncirin、isorhamnetin-3-O-rutinoside、flavaprin和5,2′-dihydroxy-7,4′-dimethoxyflavanone。利用标准品进行绝对定量确认，poncirin和isorhamnetin-3-O-rutinoside在成熟果实中的含量分别约为8 ng/mg干重和85 ng/mg干重。

3.3 负离子模式下黄酮的组织特异性积累

共鉴定到46种黄酮化合物，以黄酮（27种）和黄烷酮（6种）为主。与正离子模式结果一致，茎、叶、花和花芽是黄酮的主要积累组织，果实总体黄酮水平和多样性最低。值得注意的是，黄烷酮类代谢物在果实中相对积累较高。采用相同两倍阈值标准，又筛选出四种果实富集黄酮：4′,5,7-trimethoxyflavonol、4′,5,7-trihydroxy-3-methoxyflavone-7-O-rutinoside、vitexin 7-O-sulfate和hemsleyanoside。综合两个离子模式，共确认八种果实富集黄酮为栀子果实的核心特征活性化合物。

3.4 八种果实富集黄酮的假定生物合成途径

基于结构分类，研究人员提出了一个假定生物合成途径：上游苯丙烷途径由苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸4-羟化酶（C4H）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL）、查尔酮合酶（CHS）和查尔酮异构酶（CHI）催化产生核心中间体柚皮素（naringenin）。柚皮素作为关键分支点前体，一方面经黄酮合酶II（FNSII）转化为芹菜素（apigenin），进而衍生出vitexin 7-O-sulfate和hemsleyanoside等黄酮类化合物；另一方面经黄烷酮3-羟化酶（F3H）羟基化生成二氢山奈酚（dihydrokaempferol），进入黄酮醇合成分支，可能产生四种果实富集黄酮醇。八种化合物可归属于黄烷酮、黄酮和黄酮醇三个亚类。

3.5 关键黄酮生物合成基因的组织表达谱

多序列比对确认了GjPAL、GjC4H、Gj4CL、GjCHS、GjCHI、GjFNSII和GjF3H的保守结构域。qPCR结果显示，上游苯丙烷基因呈现不同的组织偏好性表达模式。核心骨架合成基因CHS1在花中特异性高表达，CHS2在果实中表达略高于CHS1。关键分支途径基因表现出明显的果实偏好性：FNSII-1在果实中特异性高表达，其次为叶片；而FNSII-2表现为叶片特异性表达。F3H在果实中转录本丰度最高。Pearson相关性分析显示，八种果实富集黄酮的相对丰度与GjFNSII-1和GjF3H的转录水平均呈显著正相关（r > 0.54，p < 0.05）。

3.6 果实富集黄酮与目标蛋白的分子对接分析

分子对接结果显示，两种苷元4′,5,7-trimethoxyflavonol和5,2′-dihydroxy-7,4′-dimethoxyflavanone的最低结合能分别为?6.87 kcal/mol和?6.72 kcal/mol，与阳性对照木犀草素（?6.83 kcal/mol）相当。其余六种糖基化黄酮的结合能显著升高，表明与KEAP1的相互作用较弱。结合模式分析显示，木犀草素可能与Val606、Gly603、Ala556、Arg415、Gly464、Val512和Gly367残基形成相互作用；4′,5,7-trimethoxyflavonol的关键作用残基包括Gly367、Ala366、Gly603、Gly364、Ala556、Arg415、Gly509、Val463和Val465；5,2′-dihydroxy-7,4′-dimethoxyflavanone则与更广泛的残基发生相互作用。

四、讨论与结论

讨论部分指出，本研究发现的果实整体低黄酮含量但选择性富集特定代谢物的模式，表明栀子果实采用的是选择性积累策略而非大量生产策略。qPCR数据支持这一解释：上游核心基因在果实中未高表达，而分支途径基因FNSII-1和F3H上调，与其对应黄酮和黄酮醇产物的富集相一致。上游基因的低表达可能归因于组织特异性转录调控或发育信号抑制核心苯丙烷途径，同时允许分支途径保持活性。从生理角度看，果实成熟过程中面临氧化胁迫，黄酮和黄酮醇作为高效活性氧清除剂，其选择性积累可能是一种适应性防御策略。分子对接预测表明两种苷元具有与木犀草素相当的KEAP1结合潜力，而糖基化衍生物预测结合力较弱，推测去糖基化可能增强KEAP1相互作用。

研究结论：本研究系统表征了栀子组织特异性黄酮谱，将FNSII-1和F3H确定为与果实富集黄酮和黄酮醇积累相关的候选调控基因。两种苷元经计算机模拟预测显示出与木犀草素相近的KEAP1结合能，但这些预测需要进一步的实验验证。尽管这些发现为理解栀子果实选择性黄酮富集提供了分子基础，但将其转化为功能性食品应用仍需开展细胞生物活性测定、食品加工条件下的稳定性测试和安全性评价等后续研究。