六种商用紫菜属物种鉴定的多重PCR检测体系开发

《Food Chemistry: Molecular Sciences》：Development of a multiplex PCR assay for the authentication of six commercial Pyropia species

商业紫菜类群（旧属紫菜属（Porphyra），近期被修订为紫菜属（Pyropia）、新紫菜属（Neopyropia）和新紫菜属（Neoporphyra）），在韩国通常称为“Gim”，在日本称为“Nori”，是全球重要的商业化海水养殖作物（Kim, Choi, & Choi, 2017; Yang et al., 2020）。这些术语涵盖多个物种和多样化的产品类型（如干燥、烘烤和调味薄片），这使得在供应链中进行准确的视觉鉴别变得复杂。在东亚，Pyropia yezoensis和P. tenera是主要栽培种（Hwang & Park, 2020）。由于紫菜被认定为富含蛋白质、矿物质和膳食纤维的营养密集型食品，全球需求不断增长（MacArtain et al., 2007; Venkatraman & Mehta, 2019）。研究人员基于这些物种在商业养殖和区域供应链中的频繁出现，选取了六个分类群（P. yezoensis、P. tenera、P. dentata、P. haitanensis、P. seriata和P. suborbiculata）用于本检测体系。尽管近期的分类学研究已将其中一些物种重新归属于新紫菜属（Neopyropia）或新紫菜属（Neoporphyra）（Yang et al., 2020），但为与商业标签标准、公共数据库记录和现有文献保持一致，本研究全程沿用其传统Pyropia命名。随着市场扩大，对这些产品进行真伪鉴定十分必要。不同Pyropia物种具有不同的感官特性，如风味和质地。然而，Pyropia物种的形态学鉴定较为困难。紫菜叶状体的表型可塑性随环境条件和生活史阶段而变化，使视觉区分不可靠（Koh & Kim, 2018; Lim et al., 2017）。在加工产品（如烘烤或调味紫菜）中，这一难度进一步增加，因为形态特征已丧失。因此，分子鉴定为验证产品组成和支持供应链透明性提供了实用工具。为克服这些限制，研究人员探索了基于遗传标记的分子技术。早期研究聚焦于核18S rRNA基因和内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer, ITS）。这些标记为红毛菜目（Bangiales）的系统发育分类提供了数据，并证明可用于区分分化谱系（Müller et al., 2001）。然而，由于近缘物种间的基因组内变异和比对困难，这些标记在商业菌株物种水平鉴定中的效用一直存在争议（Kucera & Saunders, 2012）。因此，分子鉴定转向细胞器基因组。质体编码的rbcL（核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基）基因和线粒体COI（细胞色素c氧化酶亚基I）基因常被用作红藻的DNA条形码（Saunders, 2005; Yang et al., 2020）。虽然线粒体COI条形码被广泛应用，但其在区分近缘Pyropia物种时的应用可能受到种内与种间变异重叠的限制（Gu et al., 2020）。rbcL基因在引物设计所需的序列保守性与物种区分所需的变异性之间提供了平衡，使其成为区分近缘Pyropia物种的靶标（Lindstrom, 2008; Saunders & McDevit, 2012）。基于这些遗传标记，研究人员开发了多种检测方法。PCR-RFLP、高分辨率熔解曲线（High-Resolution Melting, HRM）分析和基于毛细管电泳（Capillary Electrophoresis, CE）的多重PCR等技术可区分Pyropia物种（Kim, Yarish, et al., 2017; Grazina et al., 2020; Yang et al., 2024）。这些依赖仪器的系统虽然有效，但对专用设备的需求限制了其在较小质量控制（quality control, QC）设施中的常规应用。相比之下，传统基于凝胶的检测方法可及性更广，但通常需要多次单重反应，或在多重体系中难以区分相似大小的扩增子。因此，在开发一种可及、单管多重检测体系方面存在方法学空白，该体系应无需PCR后CE或测序。此外，由于商业紫菜制造过程中的热烘烤和调味工艺会损伤DNA，任何拟议的检测体系都必须直接针对这些加工产品进行验证。在本研究中，研究人员旨在开发一种针对rbcL基因的多重PCR检测体系，用以区分选定的六个Pyropia物种。该检测体系的设计基于以下假设：将rbcL基因内的物种特异性SNP与错配工程引物相结合，可在标准琼脂糖凝胶上产生可区分的片段大小编码扩增子。为评估该检测体系的实际应用，研究人员通过引入多位点采样策略对商业加工紫菜产品进行了分析，以评估单张薄片内的物种分布。

六种商用紫菜属物种多重PCR鉴定方法的开发：基于rbcL基因的物种鉴别与商业产品应用

一、研究背景与问题

紫菜是重要的经济海藻，在韩国称为“Gim”，在日本称为“Nori”。其商业产品包括干燥、烘烤和调味薄片等多种形式。由于不同紫菜物种在风味和质地上存在差异，且加工过程破坏了形态特征，传统形态学鉴定难以满足供应链中的物种真实性核查需求。现有分子鉴定方法虽然能够区分部分物种，但往往依赖毛细管电泳或实时荧光定量PCR等专用仪器，不适用于常规质量控制实验室。因此，开发一种简便、经济、单管即可完成且无需昂贵仪器的多重PCR检测方法具有重要的应用价值。

二、研究目的与主要工作

研究人员选取六个商业相关紫菜分类群（Pyropia yezoensis、P. tenera、P. dentata、P. haitanensis、P. seriata和P. suborbiculata），以叶绿体rbcL基因作为靶标，通过等位基因特异性PCR（AS-PCR）原理设计引物，即引物3′末端定位于物种特异性单核苷酸多态性（SNP）位点，并在倒数第二位或倒数第三位引入故意错配以增强特异性。经筛选优化，最终建立了一个包含六个正向引物和一个通用反向引物的多重PCR体系，可产生172 bp至781 bp不等的片段大小编码扩增子，通过常规琼脂糖凝胶电泳即可区分六个目标物种。研究人员进一步将该方法应用于20个市售加工紫菜产品，并采用多位点采样策略评估单张薄片内的物种空间分布。

三、关键技术与方法

1. 参考菌株的遗传鉴定：从韩国国立水产科学研究院（NIFS）海藻生物库获取六个目标物种的参考菌株，提取总DNA，扩增并测序rbcL基因区段（约1121 bp），通过BLASTn比对和邻接法（NJ）系统发育分析确认物种身份。
2. 引物设计与筛选：从NCBI GenBank下载162条rbcL序列，使用ClustalW、MAFFT和MUSCLE进行比对，利用DnaSP v6分析种内变异和单倍型多样性，鉴定保守物种特异性SNP。设计47个候选正向引物，通过单重PCR梯度退火温度筛选，最终选出六个特异性正向引物与一个通用反向引物。
3. 多重PCR优化：通过梯度PCR确定最佳退火温度为54°C，调整各引物浓度（正向引物各0.25 μM，通用反向引物0.5 μM），在单一反应管中实现六种目标物种的特异性共扩增。
4. 分析性能验证：包括分析灵敏度检测（连续稀释基因组DNA）、二元混合模型检测（P. dentata与P. haitanensis不同比例混合）、排他性检测（使用三种非目标商业海藻Undaria pinnatifida、Saccharina japonica和Ecklonia cava的DNA）。
5. 商业产品应用：从当地市场购买两批共20个调味或烘烤紫菜产品，每张薄片取多个边缘位点（约1 cm直径，约5 mg组织）独立提取DNA并进行多重PCR，并通过Sanger测序验证代表性扩增子。

四、研究结果

1. 参考菌株的遗传鉴定：六个参考菌株的rbcL序列与GenBank中相应物种的参考序列具有99.91%–100%的一致性和100%的查询覆盖率。系统发育树显示各物种形成清晰的独立分支。种间序列相似度范围为0.919–0.982，其中P. tenera与P. yezoensis最高（0.982），P. yezoensis与P. seriata最低（0.919）。

2. 种内变异与单倍型分析：基于162条rbcL序列（1089 bp比对区域），共鉴定出48个单倍型。P. yezoensis多样性最高（18个），其次为P. suborbiculata（9个）、P. haitanensis（7个）、P. dentata（7个）、P. seriata（5个）和P. tenera（2个）。每个物种存在5–23个保守的物种特异性SNP，适合用于标记开发。

3. 引物设计与单重特异性测试：共设计47个候选正向引物。在52°C退火温度下存在引物二聚体，60°C下部分引物无法扩增，56°C下获得特异性与二聚体形成的良好平衡，选出候选引物。

4. 多重PCR优化：在54°C退火温度下，最终引物组合（de_921、ye_798、te_744、ha_575、su_489、se_312）可产生阶梯状扩增图谱，六个条带大小分别为172、295、349、518、604和781 bp。当使用六物种等量混合DNA模板时，se_312引物组合可扩增五个目标，se_255引物组合仅扩增两个目标，因此选择se_312组合。

5. 二元混合模型和排他性：在P. dentata与P. haitanensis的5:5、8:2、9:1和9.5:0.5比例混合模板中，两个目标均能检出，即使次要成分仅占总DNA的5%也能检测。该结果仅针对二元混合体系，不能直接推广至复杂多物种基质。排他性测试显示，对U. pinnatifida、S. japonica和E. cava无扩增，证明方法特异性良好。

6. 分析灵敏度：连续稀释基因组DNA（10、1.0、0.1 ng/μL），在10 ng/μL浓度下所有六种目标物种均能稳定检出；1.0 ng/μL下条带变弱；0.1 ng/μL下除ha_575外其余无扩增。因此，该多重PCR的分析灵敏度为10 ng/μL。

7. 商业产品应用：20个商业产品中，多位点采样显示多数产品含有多种Pyropia物种。第一批10个产品中，4个为单一物种（P. yezoensis或P. dentata），其余为两种或三种物种的混合物。第二批10个产品中，6个为单一物种（P. dentata、P. yezoensis或P. seriata），其余为混合物。两个标签明确标注P. dentata的产品均检测到P. dentata。单张薄片内不同采样点的物种组成存在差异，表明商业紫菜薄片是切碎的叶状体物理混合而成，空间分布不均。代表性单一条带经Sanger测序验证，与预期物种高度一致（99.12%–100%）。从代表性商业产品提取的DNA在稀释至1.0 ng/μL时仍可检出目标扩增子。

五、讨论与结论

讨论部分指出，基于rbcL基因的多重PCR方法相较于HRM分析和CE-based多重PCR，无需实时荧光定量PCR仪或毛细管测序仪，仅需标准热循环仪和常规琼脂糖凝胶电泳，降低了设备门槛。从PCR扩增到凝胶条带可视化约需2.5小时（不含DNA提取时间）。尽管研究未进行成本和时间对比，但该方法的操作特性表明其可作为常规实验室的实用初步筛选工具。研究同时承认，在高度复杂的多物种基质中同时共扩增所有目标存在技术挑战，因为存在竞争性扩增。此外，正式用于监管质量控制（QC）前，还需利用不同地理来源的分离株和非目标分类群进行综合验证。作为初步筛选工具，该方法能有效协助标准实验室验证物种标签声明，检测未声明的物种替代（无论是意外还是经济动机所致），从而提高供应链透明度并支持全球紫菜市场的公平贸易。

研究结论：研究人员开发了一种多重PCR检测体系，用于六个主要商业Pyropia物种的分子鉴定和区分。通过靶向rbcL基因并利用带故意错配的等位基因特异性引物设计，该方法产生可区分的片段大小编码扩增子（172–781 bp），使研究者能够使用标准琼脂糖凝胶电泳直接进行可视化物种鉴定，无需专用高成本分析设备。该方法在二元混合模型。