《Food Chemistry: X》：Nitrogen-modified atmosphere with re-aeration storage triggers deterioration in paddy rice by disrupting central carbon metabolism
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氮气气调贮藏（nitrogen-modified atmosphere storage, NMAS）作为一种绿色高效的物理保鲜技术，已被广泛应用于稻谷贮藏。然而，气调环境一旦解除，稻谷在复氧贮藏（re-aeration storage, RS）阶段可能发生
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氮气气调贮藏（nitrogen-modified atmosphere storage, NMAS）作为一种绿色高效的物理保鲜技术，已被广泛应用于稻谷贮藏。然而，气调环境一旦解除，稻谷在复氧贮藏（re-aeration storage, RS）阶段可能发生品质的快速劣变，其潜在机制尚不明确。本研究以粳稻品种金粳优（Jinjingyou, JJY）和籼稻品种C两优丝苗（C-liangyou Simiao, CLS）为材料，设置了常规贮藏（conventional storage, CS）、99% N2气调贮藏40天后复氧至360天（HCN-RS）以及95% N2气调贮藏180天后复氧至360天（LCN-RS）三种贮藏条件，系统研究了氮气气调复氧贮藏（NMA-RS）对稻谷品质及中央碳代谢的影响。结果表明，与CS相比，NMA-RS在贮藏末期显著降低了稻谷的新鲜度、发芽率、ATP含量及能荷（energy charge, EC）水平。酶活测定显示，NMA-RS抑制了糖酵解途径中磷酸果糖激酶（phosphofructokinase, PFK）、磷酸戊糖途径（pentose phosphate pathway, PPP）中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase, G-6-PDH）和6-磷酸葡糖酸脱氢酶（6-phosphogluconate dehydrogenase, 6-PGDH）、三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle, TCA）中线粒体异柠檬酸脱氢酶（mitochondrial isocitrate dehydrogenase, ICDHm）以及ATP合酶等关键酶的活性。基于中央碳代谢靶向代谢组学分析，共筛选出果糖-6-磷酸（fructose-6-phosphate, F6P）、鸟苷一磷酸（guanosine monophosphate, GMP）、腺苷一磷酸（adenosine monophosphate, AMP）、胞嘧啶及尿黑酸（homogentisic acid, HGA）等5种关键差异代谢物。KEGG通路富集分析进一步表明，NMA-RS显著扰动了与能量代谢、氨基酸代谢及核苷酸代谢相关的通路。综上所述，NMA-RS通过抑制中央碳代谢关键酶活性并扰乱相关代谢通路，导致稻谷能量供应不足与代谢失衡，从而在复氧贮藏后期加速了稻谷的品质劣变。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
稻谷是全球最重要的粮食作物之一，对保障粮食安全具有举足轻重的地位。稻谷生产具有季节性，而消费需求是连续性的，因此收获后的稻谷通常需要长期贮藏，在中国贮藏期往往超过一年。在贮藏期间，稻米籽粒主要依靠自身的营养储备来维持代谢活动并应对不利环境条件。这些储备物质以淀粉为主，通过糖酵解、三羧酸循环和磷酸戊糖途径被动员和转化，为细胞提供能量和碳骨架。中央碳代谢作为细胞能量产生和碳骨架供给的核心网络，包含糖酵解、三羧酸循环、线粒体电子传递链和磷酸戊糖途径，其代谢中间产物为核酸、氨基酸、脂肪酸及多种次生代谢物提供底物，在调控稻谷贮藏品质中发挥关键作用。
贮藏环境的气体组成、温度、湿度和贮藏时长是影响稻谷生理活性和代谢速率的主要因素。氮气气调贮藏技术通过主动调控环境气体组成，已被广泛应用于稻谷贮藏实践，在防治贮藏害虫和微生物方面效果显著，并具有一定的延缓稻谷陈化能力。然而，气调贮藏的保护效应并非永久性的，一旦气调环境被移除，稻谷在复氧后可能表现出品质的快速劣化。此前的研究表明，复氧后稻谷的品质劣变可能与其呼吸代谢的显著改变有关。呼吸代谢的强度直接决定营养物质消耗速率和产热水平，进而影响贮藏品质，而中央碳代谢作为呼吸代谢的核心通路，构成了生物体内能量转化和生物合成的基础生化网络。因此，本研究采用中央碳代谢靶向代谢组学方法，系统追踪复氧贮藏期间稻谷中糖酵解、磷酸戊糖途径、三羧酸循环及相关氨基酸等关键通路中间代谢物的变化，旨在揭示氮气气调复氧贮藏条件下稻谷品质劣变的代谢特征与机制。
二、研究设计与主要技术方法
研究人员选用2023年收获的粳稻品种金粳优和籼稻品种C两优丝苗两种稻谷为实验材料，均产自中国江苏省。实验设置三种贮藏条件：常规贮藏、99% N2气调贮藏40天后复氧至360天（HCN-RS）、95% N2气调贮藏180天后复氧至360天（LCN-RS），所有条件均维持在25°C和65%相对湿度。氮气浓度和处理时长的选择依据中国粮食储藏行业标准LS/T 1225–2022制定。研究采用的主要关键技术方法包括：溴麝香草酚蓝比色法测定稻谷新鲜度，纸床发芽法测定发芽率，ELISA试剂盒测定ATP、ADP和AMP含量，商品化试剂盒测定己糖激酶（HK）、磷酸果糖激酶（PFK）、丙酮酸激酶（PK）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PDH）、6-磷酸葡糖酸脱氢酶（6-PGDH）、线粒体异柠檬酸脱氢酶（ICDHm）和ATP合酶等关键酶活性，以及基于UHPLC-MS/MS的中央碳代谢靶向代谢组学分析，共检测140种目标代谢物，经数据预处理后保留95种代谢物用于后续统计分析。
三、研究结果
3.1 新鲜度和发芽率的变化
新鲜度是反映稻谷陈化过程中产生的总酸性物质的关键指标。研究发现，所有贮藏条件下两种稻谷的新鲜度均随贮藏时间延长而下降。贮藏40天时，HCN-RS组与CS组新鲜度无显著差异；贮藏180天时，LCN-RS组新鲜度显著高于CS组和HCN-RS组，表明该方案在180天内对新鲜度的保持更为有效。然而至360天贮藏结束时，HCN-RS和LCN-RS两组的新鲜度均显著低于CS组，提示气调环境一旦解除可能产生反弹效应，导致贮藏末期更大的品质损失。发芽率方面，两种稻谷的发芽率在所有贮藏条件下均随时间下降，360天时HCN-RS和LCN-RS组的发芽率均显著低于CS组，与贮藏末期代谢差异密切相关。
3.2 ATP、ADP和AMP含量的变化
360天贮藏结束时，两种稻谷在HCN-RS和LCN-RS条件下的ATP含量均显著低于CS组，ADP含量在三组间无显著差异，而HCN-RS组的AMP含量显著高于CS组。能荷按公式EC=(ATP+0.5ADP)/(ATP+ADP+AMP)计算。180天时，两种稻谷HCN-RS组的能荷显著高于CS组，可能归因于超高浓度氮气环境诱导的低氧胁迫引发细胞损伤，复氧后细胞激活了应激修复反应。至360天时，HCN-RS和LCN-RS组的能荷均显著低于CS组，与新鲜度和种子活力的加速下降相关。
3.3 己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶活性的变化
糖酵解途径中，HK、PFK和PK分别调控糖酵解的起始、中间和末端步骤。对于粳稻JJY，360天时HCN-RS和LCN-RS组的HK活性显著高于CS组，而PFK活性显著低于CS组。对于籼稻CLS，360天时仅HCN-RS组的PFK活性显著低于CS组。研究表明PFK活性降低会显著降低水稻种子发芽率，这与发芽率结果一致。与CS下糖酵解酶活性的缓慢稳定下降相比，HCN-RS和LCN-RS下糖酵解代谢表现出更剧烈的波动，可能与更严重的细胞能量失衡和生理衰退有关。
3.4 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡糖酸脱氢酶活性的变化
磷酸戊糖途径是细胞NADPH和核糖-5-磷酸的主要来源，在抗氧化防御和核苷酸代谢中发挥关键作用。180天时，两种稻谷在HCN-RS和LCN-RS组的G-6-PDH活性均显著高于CS组；360天时，两种稻谷在HCN-RS和LCN-RS组的G-6-PDH和6-PGDH活性均显著低于CS组。结果表明NMA-RS在贮藏末期显著抑制了磷酸戊糖途径，可能削弱细胞抗氧化防御系统并减少核苷酸合成底物供应，参与复氧贮藏下稻谷品质的加速下降。
3.5 线粒体异柠檬酸脱氢酶和ATP合酶活性的变化
ICDHm是三羧酸循环的关键限速酶，催化异柠檬酸氧化脱羧生成α-酮戊二酸和NADH。360天时，两种稻谷在HCN-RS和LCN-RS组的ICDHm活性均显著低于CS组。ATP合酶是线粒体氧化磷酸化系统的核心酶，直接决定细胞能荷状态和能量转换效率。360天时，两种稻谷在HCN-RS和LCN-RS组的ATP合酶活性均显著低于CS组。值得注意的是，HCN-RS组两种酶的活性从40天到180天呈现显著上升趋势，与能荷变化一致，但长期贮藏后仍呈现快速下降趋势。复氧可能诱导应激代谢和活性氧生成，损伤线粒体膜并抑制关键酶活性。发芽率下降伴随ATP含量、能荷、ICDHm和ATP合酶活性的同步显著降低，表明种子活力丧失与线粒体能量产生受损密切相关。
3.6 靶向代谢组学分析概述
经数据预处理后保留95种代谢物，包括47种有机酸及其衍生物、17种有机氧化合物、13种核苷、核苷酸及类似物、10种有机杂环化合物、4种脂质及类脂分子、3种苯系化合物和1种有机氮化合物。主成分分析显示不同贮藏条件下稻谷样本呈现明显分离，JJY和CLS的第一主成分和第二主成分分别解释了53.7%和57.8%的总方差。OPLS-DA模型的成对比较均显示清晰分离，并通过200次置换检验验证了模型可靠性。
3.7 差异代谢物分析和KEGG代谢通路分析
以VIP>1且p<0.05为标准筛选差异代谢物。JJY品种中，HCN-RS vs CS比较发现17种差异代谢物（11种上调、6种下调），LCN-RS vs CS比较发现20种差异代谢物（5种上调、15种下调）。CLS品种中，HCN-RS vs CS比较鉴定出12种差异代谢物（6种上调、6种下调），LCN-RS vs CS比较得到10种差异代谢物（2种上调、8种下调）。KEGG通路富集分析显示，JJY中HCN-RS与CS的主要差异体现在糖酵解、磷酸戊糖途径、三羧酸循环和氨基酸代谢等通路；LCN-RS与CS的差异主要涉及氨基酸代谢、氮代谢及特定生物合成通路。CLS中HCN-RS与CS的差异集中在氨基酸生物合成和能量代谢，LCN-RS与CS的差异涉及甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢及谷胱甘肽代谢。总体而言，能量代谢、氨基酸代谢及核苷酸和辅因子代谢相关通路变化最为显著，JJY比CLS表现出更明显的代谢变化，HCN-RS组相对CS的代谢扰动大于LCN-RS组。
3.8 氮气气调复氧贮藏对中央碳代谢的共同影响
通过韦恩图分析两种稻谷共同的差异代谢物。HCN-RS vs CS比较中，果糖-6-磷酸（F6P）、鸟苷一磷酸（GMP）、腺苷一磷酸（AMP）和胞嘧啶为共同差异代谢物，主要涉及碳水化合物代谢和核苷酸代谢。LCN-RS vs CS比较中，尿黑酸（HGA）为唯一共同代谢物，是酪氨酸代谢的产物。F6P是糖酵解的关键中间代谢物，在HCN-RS下两种稻谷均显著积累，其积累与PFK活性降低密切相关，可能限制糖酵解下游通量，减少能量代谢通量并扰乱碳骨架平衡。GMP是RNA合成的直接前体，可进一步磷酸化形成GTP为蛋白质合成等生化反应直接提供能量。AMP作为腺苷酸库的重要组成，其积累反映了能量代谢的紊乱状态。胞嘧啶作为嘧啶代谢的组成部分，其水平变化指示了核苷酸代谢的扰动。HGA作为酪氨酸代谢的产物，其变化反映了氨基酸代谢的紊乱。
四、讨论与结论
研究结果表明，氮气气调贮藏复氧后稻谷品质劣变的加速与中央碳代谢的紊乱密切相关。NMA-RS通过抑制糖酵解、磷酸戊糖途径、三羧酸循环和氧化磷酸化等中央碳代谢通路中关键酶的活性，导致F6P等代谢中间物积累、能量产生受阻、能荷水平下降，进而影响核苷酸代谢、氨基酸代谢和能量代谢等下游通路。这种代谢失衡削弱了细胞的抗氧化防御能力和生物合成能力，最终表现为稻谷新鲜度、发芽率和贮藏品质的加速下降。研究还发现不同稻谷品种对NMA-RS的代谢响应存在差异，粳稻JJY比籼稻CLS表现出更明显的代谢变化，HCN-RS方案比LCN-RS方案造成更大的代谢扰动。该研究揭示了NMA-RS导致稻谷品质劣变的代谢机制，为优化氮气气调贮藏工艺和复氧管理策略提供了理论依据，对保障稻谷长期安全贮藏具有重要的实践指导意义。
