新型核桃来源降脂肽的筛选与鉴定及其降脂效果的评估

《Food Chemistry》：Screening and identification of novel walnut-derived hypolipidemic peptides and evaluation of their hypolipidemic effects

　　

摘要

核桃肽通过缓解高血脂相关症状并调控关键基因来改善脂质代谢，但其具体的活性降脂序列尚未被鉴定，限制了其降脂潜力。本研究在优化的酶解条件下对核桃蛋白水解物进行超滤分离，发现分子量（Mw）< 3 kDa 的组分表现出最高的降脂潜力（胰脂肪酶，PL：51.35 ± 0.98%；胆固醇酯酶，CE：45.63 ± 1.50%）。利用自主设计的 PeptidasGAN 模型和随机森林（RF）方法构建了降脂肽预测模型，并基于该模型从 MW < 3 kDa 的组分中筛选并鉴定出三条高活性降脂肽（VLTL、LFL 和 LVV）。体外实验结果表明，这三条肽对高血脂的关键靶点 PL 和 CE 均表现出强效抑制活性，IC?? 值分别约为 0.027 mg/mL 和 0.070 mg/mL，与阳性对照相当。分子相互作用和分子动力学模拟结果表明，肽-靶点复合物采取稳定构象，自由能分析进一步证明了其明确的能量优势。此外，3T3-L1 细胞实验表明，这些肽显著改善了脂质积累及脂质相关指标（TC、TG、LDL-C 和 HDL-C），从而证实了其潜在降脂活性。总体而言，本研究鉴定的三条源自核桃的降脂肽表现出有效的降脂活性。

引言

高血脂是一种以脂质代谢紊乱为特征的代谢性疾病，通常表现为血浆总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平异常升高，或高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）水平异常降低（Pirillo et al., 2021; Sun et al., 2025）。高血脂与心血管疾病、中风、2 型糖尿病及其他代谢障碍密切相关（Chang, Liu, et al., 2025）。其相关并发症涉及多种炎症通路，如动脉粥样硬化病变中的炎症反应（Bao et al., 2020），突显了对有效脂质调节干预措施的迫切需求。此外，血管并发症如主动脉夹层也与代谢紊乱引起的平滑肌细胞功能障碍密切相关（Pu et al., 2025）。因此，血脂异常已成为一项重要的全球公共卫生威胁（Wang, Guo, et al., 2025）。

目前，他汀类和贝特类是最常用于治疗高血脂的化学药物，一些靶向 PCSK9 的新型治疗策略也显示出改善高血脂及相关动脉粥样硬化的前景（Wang et al., 2024）。尽管这些药物能有效改善脂质紊乱并降低血浆胆固醇水平，但其应用受到一定副作用的限制（Sobukawa et al., 2024）。因此，开发来源于天然产物的安全有效降脂化合物已成为研究热点。研究表明，食品来源的生物活性物质在改善脂质代谢和调节代谢相关功能方面具有显著潜力。例如，已从菜籽蛋白（Yang et al., 2023）、橄榄副产物（Prados et al., 2023）和小麦蛋白（Liu et al., 2021）中分离出降脂肽。此外，来自天然植物来源具有代谢调节功能的生物活性化合物也得到了系统探索，例如从忍冬属植物中鉴定出的降糖活性化合物（Wu et al., 2024）。

核桃不仅富含多不饱和脂肪酸和微量营养素，其蛋白酶解产物——核桃肽，近期因其成本低、易获取、毒性低以及在多种代谢性疾病中的功能性活性而受到广泛关注（Zhao et al., 2023）。与其他植物和谷物蛋白相比，核桃蛋白具有更好的营养和功能特性，含有较为均衡的必需氨基酸组成。此外，核桃油加工副产物富含蛋白质，已被证明是各种生物活性肽的良好来源，为核桃蛋白的高值化利用提供了基础（Liu et al., 2022）。现有研究表明，核桃肽能有效缓解高脂饮食引起的体重增加，降低血清胆固醇和甘油三酯水平，并改善载脂蛋白（Apo）-B 和 Apo-A1 的异常表达。此外，核桃肽还能调控与高血脂密切相关的关键基因（LCAT、CYP7A1、HMGR、FAS）的水平，从而发挥有效的代谢调节作用（Duan et al., 2021）。因此，进一步从核桃肽中筛选高活性降脂肽序列对于充分发挥其脂质调节潜力和实际应用价值至关重要。

生物活性肽的发现主要依赖于传统实验和虚拟筛选。尽管传统方法可靠，但耗时费力；而数据库预测和分子对接等虚拟筛选方法受限于数据库更新滞后和肽的柔性构象，制约了其实际应用（Chang, Wang, et al., 2025）。相比之下，基于机器学习的生物活性肽筛选方法能够提取肽序列、理化及结构特征，从而高效准确地从大规模肽库中鉴定潜在的功能肽（Yu et al., 2024; Zhang, Jiang, et al., 2024）。此外，与传统实验工作流程相比，基于机器学习的方法能有效降低实验过程中人为失误的风险。传统肽发现依赖于耗费人力的实验，这些常规方法容易受到人为变量的影响，包括样品制备不一致、操作人员仪器校准误差以及数据解读的主观判断，从而引入随机误差。相比之下，AI 驱动的筛选不受肽库规模限制，且无需在获得结果之前对肽进行物理合成，因此能够探索比传统方法更广泛的化学空间并有效减少实验误差（Cao et al., 2026）。在一些肽筛选过程中已取得了良好的效果。例如，AMP-Hunter 在食品来源抗菌肽筛选中达到了 95.82% 的准确率（Zhang et al., 2026）；GAC-BiTCNN-AMP 模型在抗菌肽的独立测试集上也达到了 95.32% 的准确率（Ali et al., 2026）。目前，限制机器学习在生物活性肽研究中应用的主要瓶颈之一是数据问题。由于湿实验室实验成本高昂，许多研究者需要依赖 UniProt 和 DBAASP 等数据库中未标记的蛋白序列。这种模糊的标注往往缺乏代表性（Ferrell et al., 2020; Van Oort et al., 2021; Wang et al., 2021）。Chang 等人指出，抗肥胖肽和抗疲劳肽模型的构建受到已报道序列数量有限的显著制约（Chang, Liu, et al., 2025）。因此，有必要利用肽生成模型来扩充现有降脂肽数据，并在此基础上开发高效的降脂肽预测模型。

本研究旨在借助机器学习工具，进一步从核桃蛋白衍生肽中开发高活性降脂肽序列，从而增强核桃肽的降脂活性。最后，本研究综合采用体外实验、分子动力学模拟和细胞降脂实验对筛选出的肽进行了降脂活性评价。本工作为降脂肽的高通量筛选及核桃基功能食品的进一步开发提供了科学指导。

章节摘要

材料

胆固醇酯酶（源元生物科技，上海，中国），4-硝基苯基丁酸酯（PNPB）（源元生物科技，上海，中国），二甲基亚砜（DMSO）（Biofroxx，德国），Tris（Biofroxx，德国），牛磺胆酸钠（SGC）（源元生物科技，上海，中国），牛磺胆酸钠（STC）（源元生物科技，上海，中国），猪胰脂肪酶（Sigma-Aldrich，美国），奥利司他（源元生物科技，上海，中国）。

核桃蛋白提取

核桃蛋白的提取

蛋白酶筛选及单因素优化

血脂和胆固醇水平的紊乱被认为是导致高血脂的重要病理因素。在脂质代谢过程中，PL 是一种关键的消化酶。抑制 PL 活性可以有效减少小肠中的脂肪吸收，从而降低体内的脂质积累。近年来，抑制 PL 等关键脂质代谢酶已被确认为预防和调节高血脂的有效策略（

结论

本研究基于开发的降脂肽预测模型（RF-HLP），从纯化的核桃肽中筛选并鉴定出三条高活性降脂肽序列（LFL、VLTL 和 LVV）。体外活性实验表明，这三条肽在高浓度下能有效抑制高血脂相关靶点 PL 和 CE，抑制效果与阳性对照相当。分子相互作用和分子

作者贡献声明

Hao Yu（余浩）：原稿撰写、可视化、方法论、形式化分析、概念构思。Rongrong Jin（金蓉蓉）：方法论、调查、形式化分析。Bingna Li（李炳娜）：方法论、形式化分析。Jinwei Liu（刘金伟）：调查、形式化分析。Ying Liu（刘颖）：指导、方法论、形式化分析。Jie Yang（杨杰）：项目管理、形式化分析。Yang Qu（屈阳）：审稿与编辑、指导、资源、项目管理、方法论、经费获取、形式化分析。

利益冲突声明

作者声明不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所述工作的情况。

致谢

本工作得到了 新疆维吾尔自治区高校基本科研业务费项目 [XJEDU2026P003]、新疆维吾尔自治区"天池人才"引进计划及新疆维吾尔自治区重大科技专项 [2022A02009, 2022A02009-3] 的资助。

Hao Yu|Rongrong Jin|Bingna Li|Jinwei Liu|Ying Liu|Jie Yang|Yang Qu