蛋白谷氨酰胺酶介导脱酰胺构建钙螯合大豆蛋白体系以改善豆腐凝胶化

《Food Hydrocolloids》：Construction of a calcium-chelated soy protein system by protein glutaminase-mediated deamidation for improved tofu gelation

　　

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  蛋白质谷氨酰胺酶增强了大豆蛋白分离物的钙螯合能力。
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  脱酰胺作用促进了钙介导的大豆蛋白凝胶形成。
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  钙螯合蛋白形成了更致密、更稳定的凝胶网络。
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  适度脱酰胺改善了豆腐质地和持水性。
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  协同的分子间相互作用增强了豆腐凝胶结构。

引言

豆腐是最具代表性的植物蛋白凝胶类食品之一，因其高营养价值、良好的质地和消费者的接受度而广受欢迎（Ullah等人，2023；Wang等人，2020）。豆腐的质量主要取决于凝结过程中大豆蛋白的聚集行为以及由此形成的凝胶网络特征，包括分子间相互作用、水分分布和结构完整性（Kohyama等人，1995）。在豆腐生产中已应用了多种凝固剂，包括盐类凝固剂如氯化镁（MgCl₂）和硫酸钙二水合物（CaSO₄·2H₂O）、酸性凝固剂如葡萄糖酸-δ-内酯（GDL）、乳酸和醋酸，以及酶类凝固剂如转谷氨酰胺酶（TGase）（Ju等人，2022）。在这些凝固剂中，CaSO₄·2H₂O被广泛应用于工业豆腐生产，因为Ca²⁺可通过静电屏蔽和离子桥接作用促进大豆蛋白聚集，从而促进三维凝胶网络的形成。然而，直接添加钙盐引起的凝结过程在很大程度上受钙离子扩散及其与蛋白分子的随机相互作用的控制，这可能导致钙分布不均、局部过度聚集和异质性凝胶结构。因此，在钙诱导的豆腐体系中可能出现持水性差、质地不佳和凝胶性质不稳定的问题（Chen等人，2021）。因此，实现钙-蛋白质相互作用的精确调控以及提高钙介导凝胶网络的均匀性，仍然是豆腐加工中的关键挑战。

近期研究表明，修饰蛋白质结构和调控分子间相互作用是提高豆腐凝胶性质的有效方法。例如，已有报道表明多糖可通过调控蛋白聚集行为和凝胶网络形成来调节豆腐质地和蛋白消化率（Hu等人，2025）。Shi等人进一步表明，豆腐渣的添加通过大豆蛋白与多糖之间的相互作用改变了豆腐凝胶的水分分布、流变特性和微观结构（Shi等人，2026）。此外，Liu等人揭示了GDL诱导的萌发大豆蛋白分离物的凝胶化行为与凝胶形成过程中的蛋白变性、聚集途径和分子间缔合密切相关（Liu等人，2025）。这些发现表明，控制蛋白质分子相互作用对于构建理想的豆腐凝胶结构至关重要。然而，大多数现有策略主要侧重于调节凝固过程中或凝固后的蛋白聚集行为，而能够在凝胶形成前控制钙-蛋白质相互作用的方法仍然有限。

在各种蛋白修饰策略中，酶促脱酰胺引起了越来越多的关注，因为它可以在温和的反应条件下精确调控蛋白结构和功能特性（Liu等人，2022b）。蛋白质谷氨酰胺酶（PG）特异性地催化谷氨酰胺侧链酰胺基团转化为羧基，而不造成广泛的肽键断裂（Zhang等人，2024a），从而在蛋白分子中引入额外的带负电荷位点。先前的研究表明，PG介导的脱酰胺可通过促进结构重排和暴露反应性基团来提高大豆蛋白的溶解性、表面特性和功能特性（Xu等人，2026）。重要的是，新生成的羧基可能为Ca²⁺提供额外的配位位点，从而可能增强钙结合能力并改变钙介导的分子间相互作用。因此，PG介导的脱酰胺可能作为一种有效的方法来调控大豆蛋白与钙离子之间的相互作用，而不仅仅是提高蛋白功能。

钙螯合提供了另一种调节钙可用性和蛋白组装行为的潜在策略。与在豆腐凝固过程中直接添加钙盐相比，预螯合的钙-蛋白体系可能实现更可控的钙分布，并减轻钙引起的快速聚集（Li等人，2022；Ye等人，2025）。先前的研究表明，钙配位可显著影响大豆蛋白体系中的蛋白构象、流变行为和凝胶强度（Cao等人，2020）。然而，仅靠钙螯合可能无法充分优化蛋白-钙相互作用，因为天然蛋白上钙结合位点的数量和分布相对有限。因此，在钙螯合前引入PG介导的脱酰胺可能提供一种协同策略，通过增加钙结合位点同时控制蛋白基质中的钙分布。然而，PG介导的脱酰胺与钙螯合对大豆蛋白凝胶化行为和豆腐形成的协同效应仍不清楚。特别是，结构修饰、钙配位、分子间相互作用、水分分布和凝胶网络发育之间如何相互关联，在此系统中尚未得到系统研究。

因此，本研究提出假设：PG介导的脱酰胺可通过引入额外的羧基来增强大豆蛋白分离物（SPI）的钙结合能力，而随后的钙螯合可调节凝胶形成过程中的钙分布和聚集动力学，从而促进形成更均匀、更稳定的豆腐凝胶网络。为验证该假设，首先对SPI进行PG介导的脱酰胺处理，随后与Ca²⁺配位，构建钙螯合脱酰胺大豆蛋白体系。系统地研究了该协同修饰策略对钙结合能力、分子结构和改性蛋白理化性质的影响。随后，通过流变学分析、低场核磁共振（LF-NMR）、质构分析、扫描电子显微镜（SEM）及其他相关测量，评估了这些改性蛋白体系的凝胶化行为和豆腐品质特征。此外，阐明了蛋白结构修饰、钙配位、分子间相互作用、水分分布和凝胶网络形成之间的关系，以阐明PG介导的脱酰胺结合钙螯合调控豆腐凝胶性质的机制。本研究为通过预组织的钙-蛋白质相互作用调控钙介导的大豆蛋白凝胶化提供了理论基础，并为改善豆腐的结构和质地质量提供了实用策略。

章节摘要

材料与试剂

大豆（南农47）购自南京农业大学农学院。PG浓缩液（80 U/mL）由解蛋白克雷伯氏菌3D9K发酵和纯化获得（Zhang等人，2024b）。钙羧酸盐指示剂、溴酚蓝和β-巯基乙醇购自麦克林生化科技有限公司（上海，中国）。乙二胺四乙酸二钠购自碧得医药科技有限公司（上海，中国）。石油醚，

脱酰胺度与钙结合能力

如图1A-B所示，脱酰胺度（DD）值随PG添加量的增加而逐渐升高，表明PG有效催化了酰胺基向羧基的转化。相应地，钙结合能力也呈现显著上升趋势，达到最大值18.405 mg/g。这些结果表明，PG介导的脱酰胺引入了额外的带负电荷羧基，从而为Ca²⁺结合提供了更多配位位点。类似现象

结论

在本研究中，PG介导的脱酰胺有效增强了大豆蛋白分离物的钙螯合能力和凝胶化性能。增加脱酰胺程度引入了额外的羧基并促进了蛋白结构重排，从而增强了钙-蛋白相互作用并调控了后续的蛋白聚集。光谱分析表明，含氧基团是参与Ca²⁺配位的主要位点。适度脱酰胺进一步改善了

CRediT作者贡献声明

张凯：原创草稿撰写、方法论、形式化分析、概念构思。王婷：项目管理、形式化分析。姚琳君：软件、方法论、形式化分析。张充：审阅与编辑、监督、项目管理

未引用参考文献

Brito-Oliveira等人，2024；Chen等人，2025；Chen等人，2021；Li等人，2023。

利益冲突声明

无利益冲突需要声明。

数据可用性

本研究期间产生或分析的所有数据均包含在本已发表的文章中。

生成式AI使用声明

在准备本文稿期间，作者使用ChatGPT（OpenAI）仅用于改进稿件的英文语言、语法和可读性。作者对所有生成的文本进行了批判性审阅和编辑。人工智能工具未用于生成、分析或解释实验数据或科学结论。所有实验工作、数据分析、科学解释和最终稿件修订均由作者完成，作者承担全部

利益冲突声明

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致谢

本工作得到海南省自然科学基金（325MS113）的支持。

张凯|姚琳君|王婷|张充