基于显微图像分析对食品表面微生物生长速率的非破坏性定量估算

《Food Microbiology》：Non-destructive and quantitative estimation of microbial growth rates on food surfaces using microscopic image analysis

　　

# 基于"有界区域"图像法的食品表面微生物生长速率定量评估

## 摘要

微生物生长是食品腐败、食品浪费和食源性疾病的主要原因，因此对食品表面微生物动态进行可靠监测对于确保食品安全至关重要。本研究利用"有界区域"实现了对微生物生长速率的高效定量图像评估。有界区域的定义为通过显微分析膜过滤器上食品样品微生物菌落时，包含细胞及其周围环形暗区的区域。我们提出了一种数学模型，该模型能够从有界区域的时间扩展中估算单个菌落的生长速率，并通过整合这些个体测量值重建群体水平的生长速率。该方法准确捕捉了肠膜明串珠菌的温度依赖性生长行为，群体水平生长速率与传统平板计数法获得的结果高度吻合。该方法使用火腿模型这一复杂食品基质进行了验证，尽管食品基质结构复杂，图像法所得生长速率与平板计数法结果一致。该方法为食品表面绝对微生物生长速率提供了一种快速、定量且非破坏性的评估手段，可支持食品质量控制和加工食品保质期准确评估的应用。

## 引言

微生物污染及食品表面的微生物生长会导致食品腐败，损害感官品质，缩短保质期，并最终导致食品损失和浪费（Snyder等，2024；Gustavsson，2011；Quintieri等，2023）。减少食品损失和确保微生物安全是可持续食品生产的关键问题，这些问题与全球倡议（如可持续发展目标SDGs，特别是目标12.3）相一致（UNEP，2021；联合国，2015）。因此，对食品上微生物生长行为的可靠高效评估对于食品质量控制和保质期确定具有重要意义。

微生物生长速率（μ）是描述微生物在各种环境条件和防腐处理下生长情况的基本参数（Le Marc等，2021；Tarlak，2023）。基于接种的挑战测试被广泛用于估算μ以及评估防腐剂和储存条件对微生物生长的影响（ISO 20976-1，2019；Lanni等，2021）。根据欧洲食品安全局的规定，此类基于接种的测试被认为是确定保质期的科学有效工具，特别是用于评估预期储存条件下的微生物生长（EFSA，2020）。μ值，尤其是最大比生长速率（μmax），被认为是定量微生物风险评估中的关键指标，也是估算保质期的微生物生长潜力重要指标（Tarlak，2023）。比生长速率μ也是预测微生物学中的重要动力学参数，通过对温度、pH值和水分活度等环境因素对μ的影响进行评估，以描述不同条件下的微生物生长行为（Chaturvedi等，2023；Tarlak，2023）。因此，一套能够估算食品表面微生物生长速率μ的系统，对于研究、微生物风险评估和实际保质期管理将具有重要价值。

平板计数法长期以来一直被用作加工食品质量控制中评估微生物生长的金标准（ISO 4833-1，2013；Jasson等，2010）。然而，该方法需要大量时间和资源，因为涉及多个劳动密集型程序，包括样品存储指定时期、均质化、系列稀释、与熔融琼脂混合、数天培养和菌落计数（Bhuyan等，2023；Jasson等，2010）。此外，该方法涉及物理破坏食品，因此无法直接对食品表面上生长的微生物进行时间序列监测。相反，微生物群体是通过在不同时间点制备的均质悬浮液间接估算的，只提供离散且独立的快照，而非同一样品中连续生长行为的监测。使用平板计数法还需要制备大量样品以获取用于估算微生物生长速率的时间序列数据，这大大增加了人力、材料消耗和分析成本。这些因素给食品行业带来了重大负担，也凸显了对快速、定量、便捷且非破坏性技术的需求，以便直接评估食品上的微生物生长。

目前已开发了多种快速分析系统来评估微生物生长和估算μ，包括基于ATP的测定、定量聚合酶链反应、基于阻抗的方法和流式细胞术（Bottari等，2015；Johnson等，2014；Narsaiah等，2012；Ou等，2017；Priego等，2011；Rantsiou等，2008；Zand等，2021）。这些方法可以显著缩短分析时间，但通常需要样品均质化、专用试剂和昂贵设备，这限制了它们在固体食品和食品表面微生物生长直接观察方面的适用性。为了补充这些方法并克服部分局限性，各种光谱和成像方法已被探索用于快速且通常非破坏性地评估食品上的微生物污染和生长。高光谱和多光谱成像技术获取空间分辨的光谱信息，已应用于微生物污染和食源性病原体的检测与分类，以及食品储存过程中微生物生长的非破坏性估算（Jin等，2023；Wang等，2025；Zhou等，2022）。然而，许多此类系统仍然依赖于昂贵仪器、大型数据集和专业专业知识，这限制了它们在常规工业质量控制中的应用。因此，仍然需要简单、快速且非破坏性的方法来估算固体食品上的微生物生长速率。

在我们先前的工作中（Tamiya等，2024），我们开发了一种基于图像分析的简单显微系统，用于评估防腐剂对食品表面异常威克汉姆酵母生长的影响。在微生物和食品表面之间放置亲水膜过滤器，以实现微生物动态的清晰可视化，同时不明显影响生长条件。在该装置中，菌落周围被环形暗区包围，该暗区与背景清晰分离，使我们能够定义"有界区域"（A），包括细胞及其周围环形暗区，作为微生物生长的基于图像的指标。通过追踪A的扩展，允许通过特定像素增长率（ΔI）对微生物生长动态进行相对比较。然而，这种分析仅限于相对比较，无法提供绝对动力学参数如比生长速率μ，这限制了其适用于保质期测试和接种挑战测试中食品安全评估等定量应用。

为解决这一空白，本研究中我们通过开发一种数学模型扩展了基于图像的系统（有界区域方法），该模型定量地将A的时间扩展与微生物生长速率μ联系起来。该框架能够从有界区域A的时间扩展中估算个体菌落的比生长速率（μi），并通过整合这些个体测量值重建群体水平的比生长速率（μpop）。该方法的性能通过与传统平板计数法在受控接种条件下（不同温度下的琼脂平板和加工食品基质——模型火腿上）进行比较进行了验证。结果表明，该基于图像的方法能够在无需耗时费力的程序的情况下估算绝对微生物生长速率μ。该方法为定量评估食品表面微生物生长提供了一种实用的、快速且非破坏性的工具，在食品质量控制和基于接种挑战测试的保质期评估中具有潜在应用价值。

## 小节摘要

### 显微成像装置

构建了一套显微成像系统，用于估算放置在食品样品上的膜过滤器上的微生物生长速率（图1）。该系统采用配备长工作距离物镜（5×；PAL-5；Sigmakoki Co., Ltd., 日本埼玉县）的同轴反射照明显微镜，能够在避免与样品表面物理接触的情况下实现稳定观察。照明由白色发光二极管（LED）点光源（SLSI-22W；Sigmakoki Co., Ltd.）提供。

### 标准琼脂上时间序列微生物学评估

时间序列显微技术捕捉了肠膜明串珠菌（L. mesenteroides）菌落在10、20和30°C标准琼脂上有界区域A的时间扩展（图2A）。定量分析显示，10°C时扩展较慢，较高温度时扩展较快（图2B）。这些趋势与使用传统平板计数法获得的微生物生长模式一致（图2C），表明如材料与方法所述，使用图像处理进行A测量是可靠的。

### 火腿模型上时间序列微生物学评估

在火腿模型基质上进行了类似的图像分析验证。尽管食品基质的结构复杂性，图像法所获生长速率与平板计数法结果保持一致。

## 讨论

本研究所述方法通过结合膜过滤器、显微图像分析和数学建模，能够非破坏性、快速且定量地评估接种微生物在食品表面的生长速率。该方法使用有界区域（A）的时间扩展和同时估算个体菌落生长速率（μi）与边距（d）的数学模型。该方法成功重建了群体水平生长速率。

## 结论

本研究证明，对"有界区域"（A）的图像分析能够高效且定量地估算食品表面的微生物生长速率。时间序列显微技术捕捉了A的时间扩展，所提出的数学模型能够同时估算个体菌落生长速率（μi）和边距（d）。通过整合个体估算值，群体水平生长速率（μpop）得以重建，并显示出与传统平板计数法获得的增长率一致。

## CRediT作者贡献声明

Kentaro Tsuda：写作—审阅与编辑，验证，方法学，形式分析，数据整理，概念构思。Akinori Ando：写作—审阅与编辑，写作—原稿，可视化。Jun Ogawa：写作—审阅与编辑，监督。Hisato Tamiya：写作—原稿，可视化，验证，方法学，调查研究，形式分析。

## 未引用参考文献

Koutsoumanis等，2020；ISO 20976-1，2019；ISO 4833-1，2013。

## 利益冲突声明

本研究由京都大学与日本新薬株式会社合作完成。资金支持由日本新薬株式会社提供，两位作者（H. T.和K. T.）为该公司员工。

## 生成式AI和AI辅助技术在稿件准备过程中的声明

在本文档准备过程中，作者使用了Microsoft Copilot以提高可读性和清晰度。在使用该工具后，作者根据需要审查和编辑了内容，并对已发表文章的内容承担全部责任。

## 利益冲突声明

? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的经济利益/个人关系：本研究由京都大学与日本新薬株式会社合作完成。资金支持由日本新薬株式会社提供，两位作者（H. T.和K. T.）为该公司员工。

## 致谢

感谢Gerald E. Smyth博士在稿件准备过程中提供的有益建议。

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Hisato Tamiya | Kentaro Tsuda | Akinori Ando | Jun Ogawa

京都大学大学院农学生命科学研究科应用生命科学系，日本京都市左京区北白川小仓町