茶叶多酚通过破坏硫化氢（H?S）信号通路增强氧化应激诱导的金黄色葡萄球菌清除作用

《Food Microbiology》：Tea Polyphenols Amplify Oxidative Stress-Induced Eradication of Staphylococcus aureus by Disrupting the Hydrogen Sulfide (H 2 S) Signaling Pathway

　　

摘要

内源性硫化氢（H₂S）作为金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）抵御氧化应激的重要保护屏障发挥着关键作用。尽管茶多酚（TPs）已被证实具有抗菌活性，但其对H₂S相关氧化还原调控的精确机制尚未得到全面阐明。本研究旨在检验以下假设：茶多酚通过破坏金黄色葡萄球菌固有的H₂S介导的抗氧化防御系统而对其发挥杀菌作用。

本研究利用DL-丙炔甘氨酸（PAG）构建了H₂S合成抑制模型（命名为WT+inh），并通过生长曲线分析、流式细胞术分析和扫描电子显微镜（SEM）将该模型对茶多酚的响应与野生型（WT）菌株进行比较。此外，还测定了活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶活性、氧化损伤标志物丙二醛（MDA）水平，以及氧化应激和硫代谢相关基因的表达情况。最后，通过外源性H₂S补充来检验硫化物是否能改变金黄色葡萄球菌对茶多酚的响应。PAG处理显著增强了细菌对茶多酚的敏感性，同时伴随细胞死亡增加和形态学损伤加剧。胞内SOD和CAT活性降低，而ROS和MDA水平显著升高。

外源性H₂S逆转了茶多酚的生长抑制作用。茶多酚相关的氧化损伤伴随着H₂S相关硫代谢和抗氧化基因表达的改变。上述发现支持了H₂S相关抗氧化防御与金黄色葡萄球菌对茶多酚敏感性之间存在关联的结论，为基于茶多酚的抗菌策略中H₂S代谢的进一步研究提供了依据。

引言

金黄色葡萄球菌是一种常见的食源性病原体，经常污染肉类、乳制品和其他食品，引起食源性疾病和中毒（Zhou等，2022）。以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）为代表的耐药菌发病率不断上升，构成了紧迫的公共卫生难题（Urriago-Osorio等，2025）。在食品加工和储存过程中，细菌细胞可能暴露于由氧气和红ox活性抗菌处理引起的氧化应激环境中。细菌减少氧化损伤的能力可能会削弱这些处理的有效性。因此，细菌的氧化应激防御机制是提升食品安全性的相关靶点。

茶多酚（TPs）是一类具有抗氧化和抗菌活性的天然化合物，已被研究作为潜在的食品级抗菌剂（Li等，2022；Shang等，2021）。它们也被应用于水处理系统的微生物控制（Wei等，2021）。尽管茶多酚通常被认为是抗氧化剂，但其氧化还原活性会随浓度和环境条件而有所变化。在抗菌浓度下，茶多酚的自氧化和氧化还原循环可产生过氧化氢和其他活性氧（ROS）。过量的ROS可损伤细菌的膜、蛋白质和核酸，从而导致细菌生长受抑制和细胞死亡（Liu等，2013；Xiong等，2017）。因此，茶多酚在食品或宿主系统中的抗氧化活性并不排除其对细菌细胞具有促氧化作用。

细菌利用多种防御机制来限制氧化损伤。内源性硫化氢（H₂S）通过清除ROS、调控铁依赖性氧化反应和维持抗氧化活性来参与细菌的氧化还原稳态（Shatalin等，2011；Toliver-Kinsky等，2019）。降低细菌来源的H₂S可增加细菌对抗菌治疗的敏感性（Sun等，2024）。这些发现表明，H₂S相关防御系统可能影响金黄色葡萄球菌对产生ROS的抗菌剂的响应。然而，该系统在茶多酚抗菌响应中的作用仍不清楚。

本研究探讨了茶多酚对金黄色葡萄球菌的抗菌活性是否与H₂S相关氧化应激防御系统有关。利用DL-丙炔甘氨酸（PAG）建立了H₂S合成抑制的药理学模型。通过测定细菌生长、细胞活力、细胞形态、相对硫化物相关信号、胞内ROS、抗氧化酶活性、丙二醛积累以及氧化应激和硫代谢相关基因表达来评估茶多酚处理的效果。通过外源性硫化物补充来检测硫化物是否能改变金黄色葡萄球菌对茶多酚的响应。因此，本研究评估了H₂S相关氧化还原防御与对茶多酚敏感性之间的关联，而未假设茶多酚直接或特异性地靶向细菌的硫代谢。

章节摘要

材料与试剂

本研究使用金黄色葡萄球菌ATCC 6538。茶多酚（总多酚含量不低于97%）和DL-丙炔甘氨酸（PAG，生化试剂级）购自上海麦克林生化科技有限公司（中国上海）。碘化丙啶（PI，生化试剂级）和LB培养基购自广东环凯微生物科技有限公司（中国广东）。基于WST-1法的超氧化物歧化酶检测试剂盒（100次测定）和

通过药理学抑制构建H₂S合成抑制模型及其表型表征

内源性H₂S通过其抗氧化特性增强金黄色葡萄球菌对外源性氧化应激的抵抗力。本研究利用DL-丙炔甘氨酸（PAG）处理野生型（WT）菌株，成功构建了H₂S合成抑制模型，命名为WT+inh（Al Ubeed等，2019）。利用醋酸铅[Pb(Ac)₂]监测野生型（WT）和抑制剂处理（WT+inh）金黄色葡萄球菌中硫化氢（H₂S）的产生。该检测方法利用H₂

讨论

本研究表明，与野生型相比，WT+inh对茶多酚处理的敏感性更高。在1×MIC（64 μg/mL）和2×MIC（128 μg/mL）茶多酚浓度下，WT+inh中PI阳性细胞的比例分别达到90.59%和96.04%。这些变化伴随着醋酸铅试纸条显色减弱、抗氧化酶活性改变以及氧化应激相关信号增强。以往研究表明，内源性H₂S有助于细菌抵御氧化

结论

与野生型相比，WT+inh在茶多酚处理后表现出更强的生长抑制、更高的细胞死亡率和更严重的结构损伤。WT+inh还表现出较低的SOD和CAT活性、较高的DCF荧光强度和MDA水平、硫代谢相关基因表达改变以及较低的试纸条相对显色强度。外源性H₂S在测试条件下提高了细菌存活率；然而，WT挽救实验中所使用的非生理浓度限制了其生理和机制

CRediT作者贡献声明

刘艳南（Yanan Liu）：撰写—审阅与编辑、监督指导、项目管理、资金获取。王亚平（Yaping Wang）：撰写—初稿。钟伟伟（Weiwei Zhong）：撰写—初稿。聂婷（Ting Nie）：验证、资源提供。于博（Bo Yu）：可视化、形式化分析。欧阳丹（Dan Ouyang）：撰写—审阅与编辑、监督指导、项目管理、资金获取。

资金资助

宁波市科技局公益计划项目（2024S127）；上海交通大学（Shanghai Jiao Tong University）STAR项目资助（YG2025QNB48）；微生物技术国家重点实验室开放项目基金（M2023-09）；江苏省海洋生物资源与环境重点实验室（Jiangsu Key Laboratory of Marine Bioresources and Environment）开放基金（SH20231207）。

利益冲突声明

作者声明本研究不存在利益冲突。

王亚平（Yaping Wang）| 钟伟伟（Weiwei Zhong）| 聂婷（Ting Nie）| 于博（Bo Yu）| 欧阳丹（Dan Ouyang）| 刘艳南（Yanan Liu）

宁波大学，浙江-马来西亚农产品加工与营养联合研究实验室，食品微生物与营养健康省级重点实验室，食品科学与工程学院，中国宁波，邮编315800