《Food Chemistry》：Enzymatic synthesis of neotrehalose: Deciphering the β-1 catalytic promiscuity of transglycolytic starch-active enzymes
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新海藻糖是一种天然存在的非还原性稀有双糖，在营养、医疗和合成应用方面具有广阔前景，但其天然丰度低且化学合成复杂，限制了商业化生产。本研究评估了淀粉活性酶作为一种以可再生底物合成新海藻糖的可持续途径。研究人员开发了一种以淀粉和/或麦芽糖作为葡萄糖基供体的一步生物
新海藻糖是一种天然存在的非还原性稀有双糖，在营养、医疗和合成应用方面具有广阔前景，但其天然丰度低且化学合成复杂，限制了商业化生产。本研究评估了淀粉活性酶作为一种以可再生底物合成新海藻糖的可持续途径。研究人员开发了一种以淀粉和/或麦芽糖作为葡萄糖基供体的一步生物催化工艺，使用来源于海栖热袍菌（Thermotoga maritima）的超耐热α-淀粉酶（AmyA）。优化条件下的产量高达23.2 g新海藻糖/L（11.60 g新海藻糖/100 g初始麦芽糖），属于已报道的最有效的酶法合成方法之一。将麦芽糖与淀粉联用产生了加合效应，提高了生产率并缩短了反应时间。机理分析表明，新海藻糖是通过在麦芽糖或麦芽低聚糖还原端发生β-异头物特异性转糖苷作用而形成的，生成以新海藻糖为核心的低聚糖中间体（NcoreO）。利用肌醇骨架进行的结构研究考察了β-葡萄糖基受体中羟基的存在及其取向如何影响酶-底物识别以及AmyA合成新海藻糖的能力。
**论文解读：淀粉活性酶AmyA的β-1催化杂泛性及其在新海藻糖酶法合成中的机制解析**
**一、研究背景与科学问题**
稀有糖因其独特的结构特性和广泛的应用前景而受到越来越多关注，可用作甜味剂、低消化性糖、益生元以及立体和区域选择性反应的合成砌块。国际稀有糖学会（ISRS）将稀有糖定义为天然丰度极低、难以经济可行地进行分离、合成或回收的糖类，这一分类不仅涵盖单糖，还包括双糖和低聚糖。新海藻糖（neotrehalose，d-Glcp-α-(1→1)-β-d-Glcp）是葡二糖家族中通过罕见的(1→1)糖苷键连接的非还原性双糖之一，与海藻糖（α-(1→1)-α）和异海藻糖（β-(1→1)-β）为异构体。新海藻糖在自然界中极为罕见，仅在蜜蜂体液、蜂王浆、部分植物花蜜及发酵制品中检测到微量存在。尽管新海藻糖的甜度仅为蔗糖的35%，但其具有低热量、抗消化、高化学稳定性、低致龋性等特性，在食品工业中可防止糖结晶、调节渗透压、增加光泽、限制发酵；在化妆品中可改善保湿性和黏度；在制药工业中可稳定疫苗和治疗制剂。然而，其独特的α-(1→1)-β葡萄糖苷键构成了重大合成挑战。化学合成通常需要复杂的保护和脱保护策略，总产率低，且使用有毒或危险化学品，对人类健康和环境构成风险。虽然已有利用黑曲霉（Aspergillus niger）葡糖淀粉酶（GA）通过葡萄糖缩合合成新海藻糖的生物催化替代方案，但在平衡状态下新海藻糖浓度极低（<1.3 g/L），即使在初始葡萄糖浓度为400 g/L的条件下也是如此。后续工业策略虽有所改进，如日本Hayashibara公司的专利工艺以麦芽糖为底物可获得10 g新海藻糖/100 g初始麦芽糖（干基），但产率仍有限。此外，负责新海藻糖合成的酶的催化机制尚未完全阐明，其中最关键的科学问题之一是β-葡萄糖基受体在淀粉活性酶转糖苷催化杂泛性中的作用——受体的结构特征如何影响糖基化酶的特异性，进而决定酶促反应的产物。基于此，本研究聚焦于来源于海栖热袍菌（Thermotoga maritima）的超耐热α-淀粉酶AmyA（EC 3.2.1.1，糖苷水解酶家族13，GH13），旨在解析其合成新海藻糖的结构基础与催化机制。
**二、研究内容与主要技术方法**
研究人员开展了一系列系统的实验研究，从酶筛选、底物优化、产物鉴定、机理推演到结构解析，逐层深入地揭示了AmyA催化合成新海藻糖的独特机制。主要涉及以下关键技术方法。（1）以AmyA为参照，对两个AmyA突变体（H222Q和F281G）以及两种环糊精葡萄糖基转移酶（CGTase，分别来源于Thermoanaerobacter sp.和Bacillus macerans）进行转糖苷酶筛选，以确定新海藻糖合成的最适酶。（2）采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法测定AmyA及其变体的淀粉水解活性；采用酚酞法测定CGTase的环化活性。（3）利用薄层色谱（TLC）监测反应产物谱，结合高效液相色谱（HPLC）和配有脉冲安培检测器的阴离子交换色谱（HPAEC-PAD）对糖类底物和产物进行分离与定量。（4）采用制备型HPLC纯化新海藻糖和单葡萄糖基肌醇产物，并通过一维（1H、13C）和二维核磁共振（NMR）技术（包括COSY、TOCSY、HSQC、HMBC）进行结构表征。（5）利用肌醇类化合物——即肌醇（myo-inositol）、d-手性肌醇（d-chiro-inositol）和d-松醇（d-pinitol）作为d-吡喃葡萄糖的固定立体化学类似物探针，研究AmyA和CGTase对β-糖基异头物的识别特异性。（6）采用密度泛函理论（DFT）计算（BP86泛函/TZVP基组，Spartan软件）对糖和肌醇类化合物进行分子构象优化和结构等效性分析。所用化学试剂购自Sigma Chemical Co.等商业供应商；CGTase分别由Amano Enzyme Inc.和Novozymes México提供；AmyA的重组表达与纯化采用大肠杆菌（E. coli BL21 (DE3)）表达系统，经热变性和尺寸排阻色谱纯化。
**三、研究结果**
**3.1 麦芽糖或淀粉初始浓度对新海藻糖合成的影响**
以麦芽糖（100 g/L）为唯一底物时，TLC分析鉴定出不同于常规α-1,4键麦芽低聚糖（G2–G7）的转糖苷产物G2′、G3′和G4′，推测为含新海藻糖核心的低聚糖（NcoreO：d-Glcp-α-(1→4)?-d-Glcp-β-(1←1)-α-d-Glcp）。经GA处理将麦芽低聚糖转化为葡萄糖、麦芽糖和二糖G2′后，通过制备型HPLC纯化及1D/2D NMR结构解析，正式鉴定G2′为新海藻糖（α-d-Glcp-(1→1)-β-d-Glcp）。HPAEC-PAD监测表明，GA处理前的新海藻糖最大浓度达7.71 g/L（即7.71 g/100 g初始麦芽糖），7小时后不再变化。添加新鲜酶后浓度无显著变化，表明反应达到平衡而非酶失活。GA处理后新海藻糖浓度从7.7 g/L升至8.1 g/L，证实NcoreO的存在。将初始麦芽糖浓度从25 g/L提高到300 g/L，新海藻糖浓度从3.3 g/L升至30.6 g/L，最高产率为10.2 g/100 g初始麦芽糖。
**3.2 以淀粉作为经济替代底物合成新海藻糖**
以100 g/L淀粉为唯一底物时，AmyA通过水解与转糖苷的协同作用将淀粉深度解聚，主要产物为葡萄糖和麦芽糖，同时检测到G1′–G4′的NcoreO产物。新海藻糖在反应1小时后才可检出，46小时后达到7.26 g/L的最终浓度。麦芽糖浓度先升至23.54 g/L，后降至约6.72 g/L。这表明以淀粉为底物时，需先经水解产生麦芽糖，因此合成新海藻糖需要更长反应时间。值得注意的是，在所有AmyA催化的反应中均未检测到海藻糖（α-(1→1)-α产物），表明酶特异性识别β异头物构型。
**3.3 淀粉/麦芽糖混合物合成新海藻糖**
将麦芽糖和淀粉各100 g/L混合作为底物时，前两小时内麦芽糖浓度从100 g/L迅速降至30 g/L，分别通过水解途径快速生成葡萄糖和转糖苷途径逐步形成新海藻糖。24小时后葡萄糖浓度达88.73 g/L，新海藻糖达23.20 g/L。该反应在约10小时内即达到新海藻糖最大浓度，而单独使用淀粉或麦芽糖至少需要20小时，表明麦芽糖与淀粉之间存在加合效应，可提高生产率并缩短反应时间。
**3.4 AmyA合成新海藻糖的机理**
基于α-淀粉酶通过双重置换机制形成共价糖基-酶中间体的催化原理，研究人员提出了两条可能的合成途径：其一，AmyA将麦芽糖裂解释放的葡萄糖基转移至游离葡萄糖的β-C1位；其二，糖基从糖基-酶中间体转移至麦芽糖或麦芽低聚糖还原端的β-C1位，形成含新海藻糖核心的NcoreO。为判别这两种途径，设计了两组实验：一组以60 g/L麦芽糖为唯一底物，另一组采用60 g/L葡萄糖+60 g/L麦芽糖混合物。两组产物谱几乎一致，表明外源游离葡萄糖不参与新海藻糖合成，排除了途径一。进一步的pNPαG（4-硝基苯基-α-d-吡喃葡萄糖苷）实验也证实，AmyA不将葡萄糖基直接转移至游离葡萄糖的β-1-OH。因此，新海藻糖合成的关键底物是麦芽糖或更长的麦芽低聚糖，其还原端的β-C1-OH作为亲核受体攻击糖基-酶中间体，形成α-(1→1)-β糖苷键，生成NcoreO，后者经α-1,4键水解逐步释放新海藻糖，构成循环转糖苷机制。
**3.5 利用肌醇研究AmyA对β-糖基异头物作为受体的识别**
利用三种肌醇类化合物作为固定立体化学的d-葡萄糖类似物探针，系统研究了AmyA和CGTase对β异头物的识别特异性。肌醇（myo-inositol）的1-OHeq、2-OHeq、3-OHeq和4-OHeq分别与β-d-吡喃葡萄糖的1-OH、2-OH、3-OH和4-OH空间对应，其糖基化产物为α-d-吡喃葡萄糖基-(1→4)-肌醇和α-d-吡喃葡萄糖基-(1→1)-肌醇，比例约为70%:30%，对应d-葡萄糖的4-OH和β-1-OH两个位点。d-手性肌醇（d-chiro-inositol）的6-OHax对应α-d-吡喃葡萄糖的1-OH，其唯一糖基化产物为α-d-吡喃葡萄糖基-(1→3)-d-手性肌醇，3-OHeq对应d-葡萄糖的4-OH，而α异头物位置的6-OHax未被糖基化，表明酶不识别α异头物构型。d-松醇（d-pinitol）在3-OHeq位有甲氧基取代，6-OH为轴向构型，完全没有检测到糖基化产物。分子模型分析进一步揭示了d-葡萄糖分子中4-OH与β-1-OH的空间等效性：通过先垂直向前180°旋转再水平向左180°旋转的双重空间旋转，4-OH与β-1-OH可呈现相同的赤道取向构型，从而解释了AmyA在C4位与β-C1位均能进行糖基转移的结构基础，而d-葡萄糖的C6–C5–O片段在旋转后缺乏结构等效物，导致了酶对4-OH的优先选择。
**四、讨论与结论**
讨论部分围绕AmyA和CGTase对β-异头物的特异性识别及其结构基础展开。肌醇探针实验和分子旋转模型共同揭示了一个核心机制：α-淀粉酶和CGTase这类淀粉活性酶之所以能在4-OH之外还能在β-1-OH位进行糖基转移，是因为d-吡喃葡萄糖分子中4-OH与β-1-OH在空间上存在等效性——通过双重180°旋转，两个羟基均可呈现赤道取向的β-异头物样构型。这种空间等效性构成了这些酶催化杂泛性的结构基础。酶对4-OH的优先选择性源于d-葡萄糖C6–C5–O片段在旋转后缺乏对应的结构等效物。以肌醇为探针的实验则进一步确证了这一模型：肌醇的1-OH（伪β异头物位）和4-OH均可被糖基化，d-手性肌醇仅在对应葡萄糖4-OH的3-OH位糖基化而α异头物位无反应，d-松醇因4-OH位甲基化而完全无活性。
研究结论部分指出，鉴于新海藻糖作为稀有双糖在甜味剂、低消化性糖、益生元和立体/区域选择性反应合成砌块等方面的应用潜力，本研究考察了一种以淀粉和/或麦芽糖为底物的生物催化工艺，为从经济的可再生底物一步酶法合成新海藻糖提供了可持续且高效的途径。在最佳条件下，AmyA以这些葡萄糖基供体合成新海藻糖的浓度高达23.2 g/L，产率为11.65%（以初始糖计），是迄今报道的最高效酶法合成新海藻糖的方法之一。麦芽糖与淀粉联用可协同提高生产率并缩短反应时间，麦芽糖在其中发挥核心作用，既充当葡萄糖基供体又在NcoreO形成中作为受体。机理分析支持新海藻糖通过麦芽糖或麦芽低聚糖还原端β-异头物的转糖苷作用生成，形成的NcoreO产物随后作为葡萄糖基供体或受体参与循环。利用肌醇衍生物作为固定立体化学的d-葡萄糖类似物进行结构特异性研究，揭示了酶对β-异头物样构型（C1和C4位赤道取向羟基）的显著偏好，而d-松醇因C3位甲氧基和C6位轴向羟基的存在而完全不被糖基化，凸显了底物识别中立体电子对位的重要性。该论文发表于《Food Chemistry》，研究证明了淀粉活性酶在β-异头物特异性糖基化中的催化杂泛性和区域选择性，为新海藻糖的生产提供了机理见解和可扩展的平台。
