超声辅助蛋白质水解与衍生化用于复杂食品基质中的氨基酸分析

《Food Research International》：Ultrasound-assisted protein hydrolysis and derivatization for amino acid analysis in complex food matrices

　　• 超声波将水解和衍生化时间缩短至 6 小时和 1 小时• 结合超声波和干块水解的性能与 AOAC 参考性能相匹配• 声空化增强了水解和氨基酸衍生化• 氨基酸的氮回收率表明蛋白质水解有效• 经过验证的方法被应用于评估 18 种复杂食品基质**引言**氨基酸组成是蛋白质质量的关键指标，因为营养价值不仅取决于总蛋白含量，还取决于必需氨基酸的含量和平衡。氨基酸还赋予食品感官和技术特性，参与风味和香气开发，并影响乳化、凝胶化和泡沫形成等功能特性 (Ozturk 等，2023; Rajendran 等，2024; Ramírez & Cava，2007; Zhang 等，2022)。因此，可靠地测定氨基酸组成对于营养评估、食品表征和加工效果评估至关重要。然而，从分析角度来看，总氨基酸测定仍然具有挑战性，因为测得的组成取决于几个连续步骤，包括蛋白质水解、衍生化、色谱分离和分析物稳定性。蛋白质结合氨基酸的测定需要在色谱分析前水解肽键。常规酸水解广泛用于此目的，但通常需要在高温下约 24 小时，并且在强酸性条件下长时间暴露可能会促进不稳定氨基酸的降解或转化 (Rutherfurd & Gilani，2009)。气相色谱分析需要额外的样品制备步骤，因为氨基酸必须衍生化以提高其挥发性和热稳定性。衍生化效率因氨基酸结构和反应条件而异，不完全反应、衍生物不稳定以及共提取的基质成分可能会影响色谱响应。因此，在不损害氨基酸回收率和分析性能的情况下缩短样品制备时间仍然是一个重要的方法学挑战。为了加速蛋白质水解，已研究了一些替代方法。例如，微波辅助酸水解可以大幅缩短水解时间 (Margolis 等，1991)，但通常专用设备和高能量条件可能会增加降解易感氨基酸的风险。超声波代表了一种潜在更易于获取的过程强化替代方案。声空化可以促进混合、分散和质量传递，并可能增加蛋白质对水解介质的可及性。然而，将超声波应用于氨基酸测定的酸水解研究仍然有限。此外，超声处理通常主要作为操作条件报告，对有效声功率等参数的表征有限，这阻碍了研究间的可重复性和比较 (Custodio-Mendoza 等，2024)。关于超声波辅助程序在食品分析中适用性的方法学差距仍然存在。先前的研究主要集中在相对简单的蛋白质系统上，而食品基质含有比例可变的蛋白质、碳水化合物、脂质和其他成分，这些成分可能会影响水解、衍生化和色谱性能 (Custodio-Mendoza 等，2024; Lu?i? & Onjia，2025; Rojas-Vidal 等，2026)。基质衍生的化合物可能在酸处理或衍生化过程中发生反应，增加了色谱复杂性，并使方法性能强烈依赖于样品组成 (Oldekop 等，2017; Williams 等，2023)。此外，研究人员很少使用氮质量平衡来评估水解效率，而在单一分析工作流程中同时使用超声波进行水解和衍生化的潜在应用也鲜有关注。因此，需要在成分多样的基质中进行评估，以确定超声波辅助氨基酸分析的适用性和局限性。在此背景下，本研究旨在开发和验证一种分析程序，该程序结合超声波与热酸水解以及超声波辅助衍生化，通过气相色谱测定蛋白质结合氨基酸。该研究系统地评估了水解条件，包括表征超声波清洗机提供的有效功率，并使用多变量方法优化了衍生化条件。随后，在具有不同组成的食品基质中评估了拟议程序，并与常规酸水解进行了比较，评估了氨基酸回收率和氮质量平衡。这种方法旨在确定超声波能否作为补充策略，在不影响分析性能的情况下缩短样品制备时间，并确定影响其应用于复杂食品的基质相关局限性。**章节摘要****化学品和材料**所有使用的试剂均为高纯度 (≥98%)，除非另有说明。三乙胺 (TEA)、氢氧化钠和盐酸 (≥ 37%) 分别购自 Sigma-Aldrich（德国）和 Vetec?（巴西）。乙腈由 êxodo?（巴西）供应，二氯甲烷由 Neon（巴西）供应。为了制备分析用标准溶液，从 Sigma-Aldrich（德国）购买了 authentic 氨基酸标准品 (LAA21; ≥ 98%)，包括 1 克 L-丙氨酸 (Ala)、L-精氨酸**超声系统的测绘与评估**使用铝箔法评估超声测绘，以识别声场强度较高且均匀性较大的区域，从而提高实验可重复性。超声波清洗机中央区域 (40 kHz，60 W 额定功率) 的穿孔更为强烈和均匀，表明声场分布均匀，正如 Giacobe 等 (2025) 所述。在这种情况下，该区域被选为放置的最合适位置**结论**本研究证明了结合干块酸水解与超声波处理及超声波辅助衍生化通过 GC-FID 测定蛋白质结合氨基酸的可行性。拟议程序将水解时间从 24 小时缩短至 6 小时，衍生化时间缩短至约 1 小时，同时保持了与参考方法相当的分析性能。验证显示了令人满意的特异性、线性、精密度和准确度。氨基酸特异性响应期间**CRediT 作者贡献声明****Luiz Eduardo Lobo e Silva：** 可视化，验证，方法学，调查，形式分析，数据整理，概念化，写作 – 初稿。**Manoela Meira Balzan：** 调查，形式分析，数据整理。**Caroline Raquel Bender：** 可视化，方法学，调查，数据整理，概念化，写作 – 审阅与编辑。**Roger Wagner：** 可视化，资源，项目管理，方法学，调查，资金获取，数据整理，**未引用参考文献**巴西卫生部 - 国家卫生监督局 / 集体董事，2017用于测定婴儿配方食品和成人/儿科营养配方中氨基酸的标准方法性能要求 (SMPRs?) 预期用途：争端解决参考方法，未注明日期**利益冲突声明**作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能会影响本文 reported 的工作。**致谢**感谢国家科学和技术发展委员会 (CNPq) PQ-2024，流程：306887/2025-8，2016 年通用公报 流程：428691/2016-1; CAPES Pró-Equipamentos 公报 11/2024 和 31/2024。南大河州研究资助基金会 (FAPERGS)，2023 年公报 09/2023 – PqG，流程：24/2551-0001571-0。本研究还由巴西高级人才进修协调局 (CAPES) - 财务代码 001 提供奖学金资助，并由国家Luiz Eduardo Lobo e Silva|Manoela Meira Balzan|Caroline Raquel Bender|Roger Wagner