无扩增Argonaute检测技术：当前研究进展、挑战及未来展望

《TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》：Amplification-free Argonaute detection technology: Current state of the art, challenges, and futuristic perspectives

　　

•可编程核酸酶Argonaute已发展成为生物分析检测工具•本综述系统全面地总结了无扩增Argonaute检测技术•同时深入探讨了该技术的挑战与展望引言核酸检测是食品安全、临床诊断、生物技术及生物安全等多个重要领域的核心支撑技术。因此，建立一种操作简便、准确可靠、特异性高且具有成本效益的新型核酸检测方法具有重要意义。[1]目前，基于实时荧光定量聚合酶链反应（qPCR）和新一代测序技术的核酸检测方法已成为各类传染性及非传染性疾病临床诊断的金标准。然而，该技术高度依赖精密仪器和专业操作人员，难以适应快速现场检测的应用场景。相比之下，等温扩增技术无需热循环仪的辅助，具有反应速率快、操作简便及现场检测等优势，已受到广泛关注并迅速发展。然而，等温扩增技术存在显著缺陷。检测特异性容易因非特异性扩增而降低。此外，对引物设计的严格要求、气溶胶污染及产物偏差等问题使其难以满足基层现场快速检测（POCT）、突发疫情筛查及资源受限场景的应用需求，限制了其大规模推广应用。[2],[3],[4]为提高检测的准确性与可靠性，研究人员常将等温扩增技术与具有特异性识别能力的可编程核酸酶相结合，借助核酸酶的靶向识别优势有效提升特异性。[5],[6]可编程核酸酶是一类能够精确识别特定核酸序列，并利用人工设计的引导分子（如crRNA、sgRNA或短DNA）执行切割、编辑或调控功能的酶蛋白。主要包括CRISPR/Cas系统、Argonaute、锌指核酸酶（ZFN）、TALEN等。其核心优势在于，仅通过替换引导序列即可实现“一把钥匙开一把锁”的靶向操作，无需改变酶本身。因此，广泛应用于基因编辑、分子诊断、合成生物学及核酸治疗等领域。[7],[8]CRISPR/Cas系统由成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白组成。通过引导RNA与Cas蛋白形成复合物并特异性识别PAM基序，在特定位点实现核酸切割。[9],[10]自2012年被开发为基因编辑工具以来，CRISPR/Cas技术取得了爆炸性发展。Cas9、Cas12、Cas13等各类Cas家族核酸酶已被广泛应用于核酸传感与检测研究。[11],[12],[13],[14]CRISPR/Cas等温检测技术通过反式切割信号放大能力实现了高灵敏度的核酸检测，突破了传统扩增检测的部分局限。然而，CRISPR/Cas仍存在固有缺陷。[15]其识别过程高度依赖前间隔序列邻近基序（PAM），限制了目标范围。Cas蛋白分子量较大，难以在体内递送，导致载体装载量不足。此外，易发生脱靶效应，引起非特异性核酸切割，严重影响检测与基因编辑的安全性。另外，RNA引导链作为关键功能组分，存在稳定性差、合成成本高及批次间重现性不一致等局限。上述瓶颈促使研究人员持续开发通用性更强、性能更优的新型可编程核酸酶系统。有趣的是，Argonaute作为一类可编程内切核酸酶，广泛存在于真核生物、细菌和古菌中。其独特的生化特性为突破现有核酸检测技术瓶颈提供了新思路。[16]与CRISPR/Cas系统相比，Argonaute系统使用化学合成的DNA寡核苷酸（gDNA）作为引导分子，具有稳定性强、室温保存、合成成本低及批次均一性好等优势，缓解了RNA引导链易降解及质量控制困难等常见局限。[17],[18]Argonaute在装载DNA或RNA引导链后，可精确识别并切割互补目标核酸，无需依赖特定PAM序列。可自由设计针对基因组中任意位点的检测探针。Argonaute对单碱基错配具有高敏感性，在SNP分型、点突变精准鉴定等场景中具有天然优势。同时，部分Argonaute变体具有强大的多轮催化活性，可通过循环切割引发级联信号放大效应，实现检测信号的高效增益。此外，Argonaute与等温扩增技术的结合可整合Argonaute蛋白的高特异性和高灵敏度的双重优势。然而，核酸扩增固有的缺陷亦不可避免。[19]预扩增不仅延长了整体检测时间，还易导致非特异性扩增产物干扰引物等问题。此外，预扩增检测的两步反应模式显著增加了实验室气溶胶残留污染的风险。尽管已有研究通过构建单管反应体系降低了污染概率，但扩增与酶切反应的最优反应条件和检测性能往往受到了牺牲。为解决上述技术痛点，Argonaute凭借其独特的生化特性，已成为无扩增检测的有前景候选方案并持续发展建立。[20]需要指出的是，本综述中“无扩增”一词特指生物传感识别前不进行目标核酸预扩增。Argonaute无扩增检测省去了目标核酸的预扩增和富集步骤，具有特异性高、设计灵活及检测快速等优势。由于免去了复杂的目标扩增过程，Argonaute无扩增检测有望与微型化及便携式检测设备相适应。此外，Argonaute无扩增检测可与多种高精度分析技术整合，包括共聚焦显微镜、荧光显微镜、计算机视觉算法、磁性条形码编码和SERS技术，构建适用于实时筛查的新型高精度检测系统。通过信号放大提升Argonaute无扩增检测灵敏度已成为分子诊断领域的研究热点。Argonaute无扩增检测不再依赖目标拷贝数扩增，而是聚焦于信号层面放大，通过产生大量报告分子或优化传感响应性能实现高灵敏检测。基于嗜温Argonaute的酶学特性，已建立ANCA和PASS等无扩增检测系统，可在等温条件下完成一步法监测，无需核酸预扩增和复杂温控程序。这大大简化了反应组分与操作流程，避免了扩增偏差和气溶胶污染风险。[21]近年来，大量综述详细阐述了Argonaute的生物传感潜力和转化应用。这些研究系统表征了代表性工程化Argonaute变体（包括PfAgo、TtAgo和CbAgo）的生化特性和功能谱，并进一步对比了基于Argonaute的传感系统与常规CRISPR/Cas在分子识别机制及技术优势方面的差异。[18],[22],[23]既往综述总结了基于Argonaute的多样化检测技术的原理与设计策略，涵盖直接核酸传感、等温扩增耦合生物传感及多酶级联检测。[24],[25],[26],[27]同时，全面记录了Argonaute系统在分子诊断中的应用，如病原微生物鉴定、微RNA检测和单核苷酸变异筛查。[28],[29],[30]此外，还着重指出了当前Argonaute传感平台的一些固有局限，包括催化效率不足、低温活性欠佳以及在复杂生物样本中基质干扰显著。[5],[31]当前综述研究主要集中于Argonaute的基础分子机制或单一Argonaute基传感系统的开发。然而，对于通过偶联Argonaute与多种功能模块（如CRISPR系统、核酸酶及纳米传感材料）构建的无扩增传感平台，尚缺乏系统的整合与横向对比分析。据此，本研究系统总结了无扩增Argonaute传感技术的最新进展与检测应用。对提升基于Argonaute的分析平台检测灵敏度的可用策略（数字化及超局部反应器、荧光编码微球、级联信号放大、纳米材料及先进技术、工程化gDNA）进行了分类（图1）。本综述还阐述了制约该技术进一步发展的关键瓶颈。此外，展望了未来研究方向与应用前景。本工作旨在为新型无扩增Argonaute检测技术的迭代优化与临床转化提供坚实的理论基础和技术参考。章节摘要Argonaute的酶学特性根据来源，Argonaute可分为真核Argonaute（eAgo）和原核Argonaute（pAgo）（包括细菌和古菌）。[32]如图2A所示，eAgo广泛存在于不同真核谱系中，可分为两大系统发育分支：Ago（eAgo）和PIWI（ePIWI）。相比之下，pAgo的序列与结构域保守性较低，因此分为三个主要谱系：长A、长B和短pAgo。生物传感研究主要聚焦于长型无扩增Argonaute与CRISPR/Cas检测的核心优势对比无扩增Argonaute检测依赖gDNA靶向切割与新生成引导链的原位级联信号放大，无需目标核酸复制扩增，仅进行信号放大，理论上避免了固有扩增缺陷。与无扩增CRISPR/Cas系统相比，两种系统均无需目标PCR/恒温预扩增，直接识别原始核酸产生数字化与超局部反应器数字检测是将均质反应体系在微尺度上分割为数十万至数百万个独立反应单元（微液滴、微孔、微腔），实现单分子/单目标分区隔离扩增检测，并以“信号有/无”数字计数方式进行定量，不同于传统的模拟荧光强度读数。[61]数字检测通过统计学实现精确检测无扩增Argonaute检测的挑战Argonaute作为新型核酸靶向可编程核酸酶，凭借其序列特异性识别和切割活性，在病原微生物检测、基因分型、液体活检等领域展现出作为PCR等扩增技术替代方案的潜力。有望实现快速、便携、低成本的肉眼检测或仪器分析。然而，在无核酸扩增的应用场景中，无扩增结论与未来展望得益于快速操作、简便实施及低污染风险，Argonaute技术已成为一种新颖且前景广阔的核酸检测策略。与传统PCR等扩增技术不同，Argonaute技术依赖于Argonaute蛋白独特的核酸识别与切割特性，显著缩短了检测时间、降低了实验成本并减少了污染概率。本技术未来的研究方向贡献声明Lu Zhao：撰写 – 审阅与编辑。Wen Kang：撰写 – 初稿，可视化。Yaru Li：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿，可视化，验证，监督，资源，项目管理，方法论，调查，资金获取，形式分析，数据整理，概念化。Feng Feng：撰写 – 审阅与编辑。Long Ma：撰写 – 审阅与编辑，资金获取。Yunfeng Bai：撰写 – 审阅与编辑利益冲突声明作者声明无利益冲突。生成式AI与AI辅助技术在写作过程中的声明在撰写本工作期间，作者使用了包括ChatGPT（OpenAI）在内的生成式AI工具，主要用于语言润色、句式重组及提升初稿的整体可读性。重要的是，所有关键科学概念、数据分析、解释、结论及论证的逻辑流均由作者原创并提出。使用这些工具后，作者对所有内容进行批判性审阅、实质性修订和严格验证利益冲突声明? 作者声明不存在可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系致谢本研究得到国家自然科学基金（22476118，32372415）、山西省基础研究计划（202303021211324，202503021212238）及山西省科技创新项目（2025L097）的资助。Wen Kang | Yaru Li | Lu Zhao | Long Ma | Yunfeng Bai | Feng Feng