《Archives of Toxicology》：Linking acute exposure to future risk: an omics-to-AOP new approach method for next-generation risk assessment in a human in vitro lung air–liquid interface model
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新方法方法学（New Approach Methodologies, NAMs）正在通过将关注焦点从顶端毒性终点转向机制性、人类相关的不良结局预测，来变革化学安全评估。本研究中，研究人员提出了一种人肺气液界面（air–liquid interface, ALI
新方法方法学（New Approach Methodologies, NAMs）正在通过将关注焦点从顶端毒性终点转向机制性、人类相关的不良结局预测，来变革化学安全评估。本研究中，研究人员提出了一种人肺气液界面（air–liquid interface, ALI）肺泡上皮模型，并与组学至不良结局通路（omics-to-adverse outcome pathway, omics-to-AOP）分析相结合，从而将急性亚致死暴露与潜在长期毒性结局联系起来。一个非致瘤性、单克隆肺肺泡上皮细胞系（Arlo），能够形成紧密的单层屏障，在基底外侧暴露于促纤维化化合物博来霉素的亚致死浓度（0, 20, 60, 100 μg/mL）。对转录组特征进行的剂量-反应模型分析，重现了博来霉素诱导上皮损伤的已知机制，与纤维化AOP中的早期关键事件一致，并能够预测下游不良结局。将转录组特征覆盖于人类肺纤维化患者活检组织的基于网络表示之上。与博来霉素暴露的小鼠肺模型相比，体外Arlo NAM表现相当，尤其是在急性暴露情景下观察细胞外基质（extracellular matrix, ECM）重构效应方面。表观基因组分析鉴定了与上皮-间质转化（epithelial–mesenchymal transition, EMT）相关的甲基化变化，提示通过表观遗传控制实现潜在的长期基因表达调控。通过将功能终点与剂量-反应转录组和表观遗传特征联系起来，这项工作为omics-to-AOP下一代安全评估提供了一种可重复的模式，并证明急性暴露可以通过以毒理基因组学为核心的资源高效型NAM进行建模，为更长期后果提供信息。
传统动物毒性测试因伦理问题及对人类结局预测能力有限而面临挑战，新方法方法学（New Approach Methodologies, NAMs）正成为化学安全评估的重要发展方向。肺纤维化等化学诱导疾病的机制复杂，传统的顶终点检测难以捕捉急性暴露引发的早期通路扰动。当前整合剂量-反应组学分析与人类气液界面（air–liquid interface, ALI）肺上皮模型、并关联不良结局通路（adverse outcome pathway, AOP）框架的研究仍较少。为此，研究人员构建了基于非致瘤性单克隆肺泡上皮细胞系Arlo的ALI模型，结合omics-to-AOP分析，以已知促纤维化化合物博来霉素为模型物质，评估急性亚致死暴露能否提示长期纤维化风险。该研究发表于《Archives of Toxicology》，证明了资源高效的体外NAM可重现体内模型的机制性响应，并为下一代基于毒理基因组学的风险评估提供了可重复的分析范式。
主要技术方法上，研究人员使用Transwell插入物建立人肺ALI肺泡上皮模型，将Arlo细胞培养至紧密单层屏障；通过生理药代动力学（physiologically based pharmacokinetic, PBPK）模拟确定暴露浓度范围。功能终点评估包括RealTime-Glo MT细胞活力测定、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放、跨上皮电阻（transepithelial electrical resistance, TEER）及ProcartaPlex免疫分析。随后提取RNA和DNA，分别进行RNA测序和简化代表性亚硫酸氢盐测序（reduced representation bisulphite sequencing, RRBS），利用DESeq2和BMDx2进行差异表达与剂量-反应分析，使用AOPfingerprintR进行AOP富集，并将转录组特征与公共来源的9个人类特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis, IPF）活检数据集及两个博来霉素暴露小鼠模型转录组数据集（GSE282477、GSE218997）进行网络比较，最后以高通量qPCR验证关键基因表达。
研究结果部分：
**屏障破坏与炎症细胞因子诱导证明肺泡上皮对博来霉素暴露的功能响应**。通过TEER、LDH和细胞因子检测，研究人员发现博来霉素在亚致死浓度（20–100 μg/mL）下不影响细胞活力，但诱导TEER下降，其中60和100 μg/mL组在72 h时恢复有限；同时检测到促炎细胞因子白细胞介素-1α（IL-1α）、白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-18（IL-18）和巨噬细胞炎症蛋白-1α（MIP-1α）随时间及浓度增加，基质金属蛋白酶-7（MMP-7）和γ干扰素诱导的单核因子（MIG）降低，表明模型可复制肺纤维化起始相关的信号改变。
**通过Omics-to-AOP方法揭示暴露的转录组机制效应**。RNA-seq剂量-反应分析在各时间点共鉴定出3,003个剂量依赖性差异表达基因（DD_DEGs），其中1,230个为所有时间点共有。AOP富集显示，24 h以早期应激和炎症通路为主；48 h出现肺纤维化相关不良结局的富集，并随时间推进至72 h持续富集肺纤维化和细胞外基质重塑等过程，提示急性暴露可触发向纤维化进展的转录组级联。
**肺泡上皮ALI细胞系NAM与小鼠肺模型的网络比较**。将Arlo的DD_DEGs映射到由人类IPF活检数据构建的STRING蛋白-蛋白相互作用网络上，并与小鼠博来霉素模型比较。结果显示，Arlo在72 h的转录组特征与小鼠急性暴露（第3天）均显著富集于以ECM重构为核心的大簇（cluster 82），表现相当；而小鼠全肺样本在免疫相关簇（cluster 8）覆盖更广，反映了单细胞类型模型难以完全捕捉免疫细胞贡献的局限性。
**博来霉素暴露肺泡上皮细胞中的表观基因组纤维化特征**。RRBS分析发现48个剂量依赖性差异甲基化区域，注释到32个基因，其中多个基因与纤维化或上皮-间质转化（EMT）相关，如CCN5、DOCK4、GPR108、RBFOX3和SDK1。7个基因同时表现出剂量依赖性甲基化改变和表达改变，提示表观遗传调控可能在急性暴露后的长期影响中发挥作用。
讨论部分指出，该NAM能够以急性暴露模式重现博来霉素诱导的肺泡上皮损伤关键机制，并通过AOP框架提示下游肺纤维化风险，与体内小鼠模型相比在ECM重构相关网络簇中表现相当，同时具有资源节约和时间高效的优势。结论部分表明，将可重复的非致瘤性细胞系、剂量依赖性转录组分析与AOP相结合，可成为现代NAM的核心组成部分；网络聚类分析有助于定位与不良结局相关的基因模块，并为评估不同NAM的覆盖能力提供基准。虽然该NAM无法涵盖顶端毒性终点和系统毒代动力学，但能够通过转录组特征应用于肺纤维化潜力的机制筛查，并为AOP导向的危害表征提供信息，为毒理基因组学NAMs的监管采纳奠定了基础。
