《Archives of Toxicology》：Scientific perspectives on in vivo developmental neurotoxicity testing: study design, regulatory context, and future directions
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（农用）化学品的发育神经毒性（Developmental Neurotoxicity, DNT）潜力依据OECD测试指南（Test Guidelines, TG）426（DNT）或纳入DNT队列的443（扩展一代生殖毒性研究，Extended One-Gene
（农用）化学品的发育神经毒性（Developmental Neurotoxicity, DNT）潜力依据OECD测试指南（Test Guidelines, TG）426（DNT）或纳入DNT队列的443（扩展一代生殖毒性研究，Extended One-Generation Reproductive Toxicity Study, EOGRTS）在啮齿类动物中进行评估。尽管EOGRTS在多个生命阶段评估生殖与神经毒性终点，但OECD 426与OECD 443在研究设计、剂量选择和暴露持续时间方面的关键差异可能使数据解读复杂化，并影响危害识别与风险评估。本稿件评估了当前DNT测试策略，并考察了旨在为监管决策生成数据的DNT-EOGRTS联合方案的可行性。该联合方案需要对EOGRTS设计进行实质性修改，其实施应谨慎对待。鉴于复杂性和后勤挑战的增加，额外的认知评估（如学习与记忆，Learning and Memory, L&M）仅应在基于物质特异性的科学论证充分时纳入。回顾性分析表明，L&M是敏感性最低的DNT终点之一，将其纳入EOGRTS并不能产生独立DNT研究的功能等效物。本综述还考察了与认知评估纳入相关的监管触发因素及近期监管决策。最后，讨论了替代方法（包括体外DNT测试组合和斑马鱼胚胎模型）的现状与局限性。总体而言，OECD 426仍是DNT评估中科学上首选的方法。尽管联合设计在技术上是可行的，但其本质上对DNT评估而言并非最优方案。综上所述，本全面综述为生成稳健的DNT数据提供了建议，同时支持注重动物福利、面向未来的监管测试策略。
论文主体内容总结
引言
发育神经毒性（DNT）评估用于评价化学品在子代从子宫内发育至青春期早期阶段暴露对发育中神经系统产生的潜在不良效应。发育中的大脑对环境侵害尤为敏感，在脑发育关键期接触某些物质可对认知、行为及神经元功能产生长期影响。DNT的信息要求因欧盟关于植物保护产品、杀生物产品或工业化学品的相关法规而异，目前有三项可用于体内DNT测试的指南：美国EPA OPPTS 870.6300指南、OECD测试指南（TG）426（DNT）以及纳入DNT队列（2A/2B）的OECD 443（EOGRTS）。尽管存在这些标准测试指南，各指南间的设计差异以及不同监管方法中触发研究开展的条件差异仍然显著。
监管背景与触发因素
欧盟杀生物产品法规（（EC）No. 528/2012）：2022年3月更新后，DNT现已成为核心数据集（CDS）中的标准信息要求。若现有数据表明物质具有发育毒性且符合生殖毒性1A或1B类分类标准（H360D），且数据足以支持稳健的风险评估，则可豁免DNT研究。BPR规定了三种可满足DNT信息要求的方案：OECD TG 426、提供与OECD TG 426等效信息的任何相关研究（组合）、或纳入DNT队列2及认知功能附加研究的OECD TG 443。ECHA的BPR指南提供了详尽的测试要求，但该指南相比其他法规信息要求尤为详尽，反映了其他支持申请人和评估主管机构（CAs）选择适当认知功能测试的ECHA指南文件的缺失。体外DNT测试组合目前尚不能完全满足最低数据要求，因为其尚不能提供与体内测试等效的信息；体外阳性发现可加强总体证据权重（WoE），但阴性结果本身不能得出无DNT特性的结论。
欧盟植物保护产品法规（（EC）No. 1107/2009）：在PPP监管框架中，DNT被视为具有特别意义的效应。近期有修订活性物质标准数据要求的草案提案，拟将DNT测试（包括认知功能）纳入核心测试要求，但截至本出版物发布时，DNT终点的实验验证尚非标准数据要求。在多项近期活性物质评审中，纳入DNT队列2A/2B的EOGRTS被接受用于解决发育神经毒性关注问题，特别是在旧版OECD 416两代研究数据存在数据缺口、且无法就甲状腺介导的内分泌干扰得出明确结论的情况下。
欧盟REACH法规（（EC）No. 1907/2006）：OECD 443于2011年7月28日通过后，DNT测试成为REACH下的可选信息要求。EOGRTS相比两代生殖毒性研究（OECD 416）在动物福利方面有重要改进，通过模块化研究设计实现减少和优化。在REACH附件IX/X（8.7.3，第2栏）下触发DNT队列2A/2B的特定关注因素可能包括：现有关于中枢神经系统（CNS）异常或成体动物神经系统不良效应的信息、与（发育）神经毒性相关的特定机制或作用模式（如胆碱酯酶抑制或甲状腺激素水平相关改变）、或结构类似物质的现有信息。ECHA曾在测试决定中要求EOGRTS-DNT队列增加认知功能测试（L&M），但在多起案例中，此类要求随后被ECHA上诉委员会（BoA）撤销，因其超出了OECD 443规定的DNT测试要求范围。
研究设计、关键终点与局限性
指南研究设计：DNT评估旨在研究物质在子宫内及出生后早期发育阶段重复暴露对神经系统发育和功能的影响。首选测试物种为大鼠。
独立DNT（OECD 426与OPPTS 870.6300）：独立DNT研究中，测试物质从着床期（如妊娠第6天）至离乳（通常为哺乳日（LD）/出生后日（PND）21）每日经口给予已交配雌性大鼠，母体暴露总时长约36-37天。每剂量组每个年龄段推荐至少评估20窝。F1子代在离乳前经子宫内和可能的乳汁间接暴露，不进行直接给药。推荐评估包括体格和发育标志物，以及功能/行为终点，包括至少两项行为个体发育指标，以及在至少两个年龄段进行的运动活动、感觉功能和L&M评估。
含DNT队列的EOGRTS（OECD 443）设计：EOGRTS中，测试物质在交配前2至10周给予成年F0雄性和年轻成年非妊娠F0雌性，给药持续至离乳。离乳时或离乳前，F1子代被选择进行离乳后直接给药，并随机分配到各队列。DNT评估推荐每剂量组至少20只大鼠幼崽（10只/性别/组，尽可能代表多窝）。F1子代在离乳后直接暴露于测试物质直至安乐死。与OECD 426不同，已发布的OECD 443指南不要求队列2A/2B进行L&M调查。近期ECHA在REACH合规检查（CCH）决定和物质评估中要求F1动物进行L&M测试，但Arts等人的批评指出，ECHA所依赖的文献并不能证明循环甲状腺素（T4）水平降低导致大鼠L&M受损。Raffaele等人对美国EPA 69项DNT研究的回顾性分析表明，L&M终点很少决定出发点（POD），敏感性低于运动活动或听觉惊愕反应，且从未作为最低观察到不良效应水平（LOAEL）确定的唯一依据。EFSA对104项DNT研究的整理也将运动活动列为最常用于推导无观察到不良效应水平（NOAEL）的终点，L&M排在最后。
联合EOGRT-DNT研究设计：OECD 443中的DNT队列从未被设计为完整的独立DNT研究。Cooper等人最初的设计方案中，DNT模块有意限制范围，使用独立DNT中功能性/认知测试通常分配幼崽数量的一半，且除听觉惊愕反应外仅要求成年F1动物进行功能评估，明确不包含L&M测试。其意图是作为可靠筛查工具以识别潜在发育神经毒性。OECD 443第51段规定，如现有信息表明需要其他功能测试，应在不损害研究中其他评估完整性的前提下整合。然而，在EOGRTS中仅使用有限队列规模（队列2A，10只/性别/组）在单一龄期进行L&M测试，在科学上不如独立DNT（20只/性别/组）稳健。即使增加组规模也无法克服联合研究固有的局限性。
剂量选择标准存在根本差异：独立DNT的剂量水平选择旨在诱导一定母体毒性，但高剂量不应导致过度子代毒性。相比之下，EOGRTS剂量水平旨在诱导一定亲代全身毒性或足以引发性功能和生育力缺陷。ECHA建议EOGRTS高剂量应诱导一定全身毒性但不可致死或导致严重痛苦，且不应为获得足够子代而降低剂量。这两种剂量选择理念不一致，EOGRTS优先考虑亲代性功能和生育力评估可能损害子代出生后发育评估，包括DNT评估。高剂量全身应激源可产生非特异性行为改变，可能被错误归因于DNT。
给药途径与暴露持续时间：两种指南均要求选择与人类暴露最相关的给药途径，通常为经口。但EOGRTS中暴露持续超过离乳期至成年，使成年期检测到的神经毒性难以区分是发育神经毒性、急性成体神经毒性还是成年期重复暴露效应。近期ECHA杀生物产品工作组要求OECD 426研究将给药延长至PND 60左右，但缺乏充分经验证据表明延长给药能一致识别标准离乳前暴露范式无法检测的不良效应，该要求引入监管不确定性。
F1大鼠幼崽直接给药：对于不分泌或少量分泌入乳汁的物质，两种指南均推荐对离乳前幼崽直接给药。文献支持约PND 10开始直接给药可捕获与人类新生儿最可比的主要CNS发育窗口。但直接给药与EOGRTS设计不兼容，因为母鼠需继续哺育分配给其他队列的所有F1幼崽。直接经口灌胃给药对幼崽是应激性操作，可能导致不同危害评估结果，应仅在特殊情况下基于个案论证采用。
F1大鼠幼崽的选择与分配：EOGRTS中，若纳入全部3个队列，每性别每剂量组可能需选择多达70只F1幼崽，但DNT评估仅分配20只（10只/性别/组）。大多数实验室需以22-25对F0繁殖对启动研究以确保足够子代，某些品系甚至需30对，这在一定程度上削弱了OECD 443减少动物使用的优势。联合EOGRT-DNT研究中，由于队列1A/1B（强制）和队列3（可选）的幼崽分配需求，可能仅能分配单一子集幼崽进行离乳后功能和神经行为测试，即仅能对同一子集动物进行纵向评估。队列1A/1B是EOGRTS的主要生殖队列，不应分配额外测试，因为每项额外操作都可能诱导应激并影响该队列对压力敏感的终点。
行为个体发育与功能评估：OECD 426要求至少两项行为个体发育指标，在离乳前和成年期评估。运动活动在独立DNT中需在多个发育时间点重复评估，而EOGRTS仅在单一时间点（成年期）评估。感觉功能（通常通过听觉惊愕反应测试评估）在EOGRTS中仅在离乳前后（PND 24±1）评估一次。L&M评估是独立DNT的组成部分，在离乳后和青年成年期分别对雄性和雌性动物子集进行。L&M测试选择需满足可接受标准：学习应通过多次重复学习试验的变化评估，测试应包含短期或长期记忆指标。常用范式包括Morris水迷宫（MWM，异我中心导航）、辛辛那提水迷宫（CWM，9T）和Biel水迷宫（BWM，6T，自我中心导航）。CWM测试耗时极长，典型四组EOGRTS可能需每天超过12小时连续试验。MWM所需时间显著较少，但支持幼年啮齿类在安全评估环境中使用该迷宫的数据有限，PND 20前海马依赖性异我中心导航尚未可靠发育。Jablonski等人的研究表明PND 30大鼠在10T CWM中无法找到目标，即使简化至6T，对照组大鼠在15天训练后也未达到完全熟练。但在安全评估环境中，有研究报告PND 30大鼠在6T BWM中成功表现。迷宫类型和测试范式的选择应基于动物年龄、训练和测试范式验证、安全评估环境中的适用性和后勤适宜性、检测阳性对照物质暴露后L&M缺陷的能力、历史对照数据可用性以及执行实验室的技术专长等多重因素。
大体脑重量、测量与神经组织病理学：大体脑重量、脑测量和神经组织病理学是DNT评估的必要组成部分，通常在离乳前后和研究终止时进行。离乳动物主要分配用于中枢神经系统（CNS）组织神经组织病理学检查，而终止剖检动物需同时检查CNS和周围神经系统（PNS）组织。青年成年动物需灌注固定神经系统组织，因其脑组织用于形态计量学（定量）评估。关于脑重量变化是否构成不良效应存在争议：一些机构将任何绝对脑重量变化视为神经发育不良效应的证据，其他机构则考虑脑重量缺陷是否伴随显著体重变化。EFSA资助的Crofton分析调查了173项公开DNT研究，发现70%的研究显示幼崽体重下降，但仅41%伴随脑重量下降，由此认为体重不能可靠预测脑重量改变。但该分析未考虑固定方法差异及母体护理影响等混杂因素。
神经行为和神经病理学终点的统计分析：OECD 443未提供神经行为和神经病理学终点的具体统计分析指导，而是参考OECD 426。两种指南均规定窝必须作为实验（和统计）单位，重复测量应进行分析以考虑测量的非独立性。功能和认知DNT终点通常从同一受试者在多个时间点采集，这些重复测量可能反映研究内多个时间间隔或单次会话内多个试验。
