血浆来源的低氧特征预测低氧修饰放疗获益并揭示膀胱癌中动态体液免疫调节

《British Journal of Cancer》：A plasma derived hypoxia signature predicts benefit from hypoxia-modifying radiotherapy and reveals dynamic humoral immune modulation in bladder cancer

　　

摘要 引言 低氧是实体瘤的标志性特征，驱动放射抵抗，但目前尚无低氧生物标志物用于临床。本研究探索了纳米蛋白质组学技术，以识别一种可用于纵向无创低氧监测的血浆蛋白特征。 方法 前瞻性纳入23例接受放疗（55 Gy，4周）的膀胱癌患者（T2–T3b）。在基线和每周收集血浆，经纳米颗粒富集后进行蛋白质组学分析。利用已验证的24基因特征从诊断活检组织中推导低氧评分（hypoxia score, HS），并根据HS中位数对患者进行分层。 结果 研究人员鉴定出115种差异丰度蛋白（differentially abundant proteins, DAPs）（|FC| > 1.5；p < 0.05）。其中7种DAPs（IGKV3, IGLV2-18, VL_4, VL_7, FN1, IGLV2-14, CAMP）在多个时间点与HS相关（p < 0.05；|r| > 0.4）。一个由两种蛋白（FN1, CAMP）组成的特征在回顾性验证中显示出预后价值：在TCGA-BLCA（n = 404；HR = 1.54；CI = 1.12–2.13；p = 0.009）、BC2001（n = 313；HR = 1.42；CI = 1.08–1.86；p = 0.011）以及荟萃分析（n = 150；HR = 1.48；CI = 1.23–1.78；p < 0.001）中均得到证实。在BCON试验（n = 150）中，该特征可预测低氧修饰治疗的获益（HR = 0.60；CI = 0.34–1.06；p = 0.079）。这115种DAPs形成了五个时间共表达簇，分别在治疗的不同周达到峰值。这些簇富集于体液免疫通路，其中一个簇与细胞外基质重塑相关。 结论 这些发现支持使用低丰度血浆生物标志物进行实时低氧分层，并揭示了放疗期间与低氧相关的动态免疫应答。

论文解读文章

研究背景与科学问题

低氧（hypoxia）是实体瘤的普遍特征，也是导致放射治疗抵抗的关键因素。在膀胱癌中，高达70%的患者存在肿瘤低氧，且无论采用何种治疗方案，低氧都与更差的患者预后密切相关。尽管已有研究证实靶向低氧可以改善膀胱癌患者的生存结局——例如英国III期BCON试验表明，在接受放疗的同时联合使用低氧靶向药物卡波金和烟酰胺（carbogen and nicotinamide, CON），可使膀胱癌患者的5年总生存率（overall survival, OS）提高17%——然而，目前临床上尚无常规使用的低氧生物标志物。此前的研究虽然开发了基于组织活检的24基因低氧相关特征（hypoxia signature），能够预测患者能否从低氧修饰治疗中获益，但该方法需要侵入性肿瘤活检，不适用于治疗过程中的连续监测。因此，开发一种微创、可重复、适合纵向监测的血浆蛋白生物标志物组合，对于实现实时低氧分层和个体化放疗调整具有重要的临床意义。

研究方法概述

为解决上述问题，研究人员开展了一项前瞻性研究，入组了23例肌层浸润性膀胱癌（muscle-invasive bladder cancer, MIBC）患者（分期T2–T3b），所有患者均接受放疗（52.5–60 Gy，分20次，为期4周）联合每周吉西他滨治疗。在基线及治疗期间的每周采集血浆样本。研究人员首次将纳米颗粒富集技术与蛋白质组学相结合，利用脂质体纳米颗粒捕获血浆中的低丰度蛋白，随后通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行蛋白质组学分析。同时，从患者诊断性活检组织中提取RNA，利用已验证的24基因低氧特征计算低氧评分（hypoxia score, HS），并以HS中位数为界将患者分为高HS组和低HS组。此外，研究人员还利用三个独立的膀胱癌回顾性队列（TCGA-BLCA、BC2001、BCON）以及TCGA泛癌队列对候选标志物进行验证。

研究结果

1. 肿瘤低氧程度差异与不同的血浆蛋白谱相关联

蛋白质组学共鉴定出816种血浆蛋白。在高HS与低HS患者之间，共有115种差异丰度蛋白（differentially abundant proteins, DAPs）（|FC| > 1.5；p < 0.05），其中51种为免疫球蛋白和补体级联蛋白。高HS患者的DAPs总体水平升高，并在放疗开始后第一周达到峰值，随后逐渐下降。富集分析显示，在所有时间点，高HS与低HS患者之间的体液免疫应答通路均存在显著差异。细胞外基质（extracellular matrix, ECM）相关通路仅在放疗前显著富集，而体液免疫通路则在放疗期间及放疗结束时占据主导地位。

2. 候选血浆低氧特征可根据肿瘤HS对患者进行分层

将DAPs与HS进行相关性分析后，研究人员筛选出7种在至少两个时间点与HS显著相关（p < 0.05；|r| > 0.4）且相关性方向一致的蛋白：IGKV3、IGLV2-18、VL_4、VL_7、FN1、IGLV2-14和CAMP。主成分分析（principal component analysis, PCA）和K均值聚类均显示，这7种蛋白的组合能够有效区分高HS与低HS患者，且存在中间评分的患者，提示循环蛋白表达与肿瘤低氧严重程度之间存在连续性关系。

3. 候选血浆低氧特征在整个放疗过程中持续对患者进行分层

进一步分析显示，在放疗全程中，该7蛋白特征的表达趋势稳定：IGKV3、IGLV2-18、VL_4、VL_7和FN1的表达水平在高HS患者中持续升高（p < 0.05），而IGLV2-14和CAMP则持续降低（p < 0.05）。层级聚类分析表明，无论处于哪个治疗时间点，患者始终被分为高HS和低HS两大聚类，证明该特征在不同治疗阶段均能可靠地反映肿瘤内低氧状态。

4. 候选双基因低氧相关血浆特征具有预后价值并可预测低氧修饰治疗获益

由于回顾性队列中缺乏免疫球蛋白相关基因的RNA表达数据，研究人员仅评估了CAMP和FN1这两个基因的组合。在TCGA-BLCA（膀胱切除术队列）和BC2001（放疗队列）中，高HS患者的10年总生存期（OS）显著更差（p = 0.0013；p = 0.0069）。在BCON试验的单纯放疗组中，高HS同样与不良预后相关（p = 0.054），而在CON联合治疗组中则未观察到这种差异（p = 0.82），表明该特征可预测低氧修饰治疗的获益。多变量Cox回归分析证实，该特征在TCGA（HR = 1.54；CI = 1.12–2.13；p = 0.009）和BC2001（HR = 1.42；CI = 1.08–1.86；p = 0.011）中独立于年龄、性别和分期具有预后价值。交互作用分析显示，高HS患者在接受CON治疗后预后改善（HR = 0.60；CI = 0.34–1.06；p = 0.079）。三项队列的荟萃分析进一步确认了该特征的预后价值（HR = 1.48；CI = 1.23–1.78；p < 0.001）。在TCGA泛癌队列中，该特征同样与不良预后显著相关（HR = 1.43；CI = 1.31–1.56；p < 0.001）。

5. 低氧相关血浆蛋白按序贯簇激活

加权基因共表达网络分析（weighted correlation network analysis, WGCNA）将115种DAPs划分为五个共表达簇（黄色、蓝色、棕色、绿色、青绿色），每个簇分别与特定的治疗时间点高度相关（p < 0.001）：黄色簇对应放疗前，蓝色簇对应第一周，棕色簇对应第二周，绿色簇对应第三周，青绿色簇对应第四周。这表明低氧相关蛋白在放疗过程中呈现逐步激活的模式。所有簇均富集于B细胞应答和免疫球蛋白产生等体液免疫通路，黄色簇还额外富集于ECM相关通路。

6. 放疗是低氧相关血浆蛋白的主要激活驱动力

通过比较各簇的蛋白表达水平和倍数变化，研究发现放疗是决定簇激活时间的主要因素，而肿瘤低氧则主要影响蛋白的基线丰度和变化的幅度。两者协同作用，共同调控放疗期间低氧相关体液免疫通路的时序性变化。

讨论与结论总结

本研究首次将纳米颗粒富集技术应用于癌症血浆低氧生物标志物的发现，鉴定出115种低氧相关血浆蛋白，其中约45%为免疫球蛋白和补体级联蛋白。从中筛选出的7种候选蛋白标志物（含6种免疫相关蛋白和1种ECM蛋白FN1）能够在放疗前后稳定地对患者进行低氧分层。其中，由FN1和CAMP组成的双基因特征在RNA水平上表现出良好的预后价值，并能预测低氧修饰治疗（CON）的获益，其表现与已获验证的Yang等人开发的24基因特征一致。研究还揭示了放疗驱动下低氧相关体液免疫通路的时序性激活模式，为理解低氧对全身免疫调节的影响提供了新的临床证据。研究人员的结论是：这些发现支持使用低丰度血浆生物标志物进行实时低氧分层，并揭示了放疗期间与低氧相关的动态体液免疫应答。