《Communications Biology》：Coral-associated denitrification is seasonally variable and species-specific
氮（N）在珊瑚生长中发挥关键作用，但维持氮限制状态对于珊瑚-藻类共生体的稳定性至关重要。珊瑚相关的反硝化细菌可能有助于调控过量的氮，然而珊瑚中的反硝化作用仍缺乏定量研究。为更好地理解物种特异性及环境因素对反硝化途径的影响，研究人员利用乙炔抑制分析法，结合生理学与环境测量，研究了四种红海珊瑚长达一年的反硝化动态。所有物种均表现出可测量的反硝化活性，其中**柱状珊瑚（Stylophora pistillata）**和**鹿角珊瑚（Acropora sp.）**为0–0.8 nmol N cm?2 h?1，**千孔珊瑚（Millepora dichotoma）**为0–0.4 nmol N cm?2 h?1，**树珊瑚科未定种（Dendrophylliidae indet）**为0–2.0 nmol N cm?2 h?1。反硝化作用呈现季节性变化模式，春/夏季的速率高于秋/冬季，研究人员将温度、溶解性有机碳（DOC）和硝酸盐可用性确定为主要环境驱动因子。最后，研究人员观察到，完全异养的、不含虫黄藻的树珊瑚科未定种的反硝化速率比携带共生藻（Symbiodiniaceae）的混合营养物种高出至多五倍。研究结果表明，反硝化细菌同时利用光合作用来源的碳和环境碳（C），其中DOC在维持珊瑚全息生物体（holobiont）碳氮循环紧密耦合中发挥核心作用。此外，反硝化作用受环境条件调控，凸显了其对环境变化的敏感性。
珊瑚礁常被称为海洋荒漠中的绿洲，能在寡营养环境中繁盛。然而，全球范围内真正处于寡营养状态的珊瑚礁比例较低，80%的珊瑚礁分布于生产力较高的中型营养或甚至富营养环境中。尽管如此，珊瑚已进化出适应低营养水体的多层次策略，能够高效地获取、处理和保留氮（N）。氮是珊瑚不可或缺的营养元素，支持蛋白质合成、繁殖和光合效率。珊瑚可通过异养摄食富含氮的猎物和颗粒有机物来满足大部分氮需求。此外，珊瑚以全息生物体（holobiont）形式存在，与细菌、病毒等多种微生物共生。固氮细菌（diazotrophs）是该复杂微生物群落的重要组成，在氮固定中发挥关键作用，为珊瑚的氮收支做出贡献。具体而言，固氮细菌将大气中的N?还原为珊瑚可利用的生物铵。此外，许多石珊瑚和软珊瑚携带共生甲藻（Symbiodiniaceae），即俗称的虫黄藻物种。共生藻能够吸收硝酸盐，而珊瑚宿主本身缺乏将硝酸盐还原为生物可利用铵的酶，因此无法直接进行该过程。共生藻向珊瑚宿主提供富含碳（C）、贫氮的光合产物，同时循环利用宿主的代谢废物（如铵），将其转化为氨基酸和其他含氮化合物并部分转运给珊瑚宿主。相比之下，不含虫黄藻的珊瑚（azoooxanthellate corals）不携带Symbiodiniaceae，因此完全依赖异养摄食和氮固定获取氮，缺乏共生氮同化和碳供应的额外益处。
在相反条件下，当氮过量时珊瑚会受到负面影响。当体内氮增多时，共生藻将更多碳分配至自身生长而非供给珊瑚宿主，促进共生藻增殖并向寄生状态转变，可能引发珊瑚白化。其结果取决于营养化学计量，尤其是氮与磷酸盐（P）的平衡。当氮富集而无相应磷增加时，共生藻因缺磷而饥饿，导致珊瑚-藻类共生关系破裂，引发光和热诱导的白化。过量氮的影响也因氮形态而异，例如暴露于尿素的珊瑚比暴露于过量硝酸盐的珊瑚恢复更快。此外，过量铵具有混合效应：中等浓度下可能有利于珊瑚的光合作用和钙化，高浓度下则产生毒性。相反，硝酸盐可能对光合作用和钙化过程均产生负面影响，因为其转化为生物可利用铵的能量代价较高。
珊瑚全息生物体缓解过量氮的机制之一是反硝化作用。反硝化是微生物过程，珊瑚全息生物体内的反硝化微生物将硝酸盐依次还原为亚硝酸盐、一氧化氮、一氧化二氮，最终还原为释放至大气的氮气。近年来该过程受到越来越多的关注，关于珊瑚礁反硝化作用的初步认识正在形成。近期研究表明，反硝化是多种红海石珊瑚和软珊瑚、古巴石珊瑚以及大堡礁珊瑚中的活跃途径。反硝化也被证实在多种底栖珊瑚礁基质（如珊瑚碎石、生物岩、藻丛和礁沉积物）中活跃存在。这些研究还揭示了不同基质和珊瑚物种间反硝化活性的差异。此外，反硝化速率与其对立途径——氮固定速率——被发现与藻类共生体密度及彼此之间均存在相关性，提示这两种途径可能具有某些相似性。例如，Tilstra等人推测调控这两种途径的异养细菌可能共享来自藻类共生体的有机碳供应。然而，尽管反硝化活性已被广泛检测到，该途径在石珊瑚整体氮去除中的重要性仍存在争议。例如，Glaze等人认为反硝化与厌氧氨氧化等其他氮去除途径相比重要性有限，而Yang等人发现反硝化占石珊瑚N?产量的约90%。需要指出的是，现有研究使用了不同的反硝化定量技术，包括定量反硝化基因（如nirS）拷贝数的分子技术（可作为反硝化的代理指标），以及示踪实验（直接法）和乙炔抑制法（间接法）等不同生理学技术，这使得研究间的直接比较变得复杂。
目前对珊瑚相关反硝化作用的理解仍存在重大知识空白。虽然先前研究已量化了多种红海珊瑚的反硝化速率，但这些测量是在硝酸盐富集条件下进行的，旨在测定反硝化潜力。因此，反硝化活性如何响应红海自然环境条件仍不清楚，特别是珊瑚相关反硝化作用的季节性变化尚属未知。红海的季节性变化显著：冬季和春季因垂直混合而温度较低（约24°C）且营养盐浓度较高（如无机氮），夏季则因分层而温度较高（约32°C）但营养盐可用性较低。季节变化对另一氮循环途径（N?固定）的影响此前已有研究，发现春季/夏季珊瑚礁的N?固定率显著高于秋季/冬季。同样，在另一项红海研究中，柱状珊瑚（Stylophora pistillata）在5、10和20米水深处的夏季N?固定率均较高。此外，先前研究推测反硝化活性与珊瑚宿主的营养策略之间存在关联，但这一假设尚未被直接验证，也尚未有研究对不同营养策略物种间的反硝化作用进行评估。
基于上述知识空白，研究人员提出了三个关键问题：i）季节性变化对珊瑚相关反硝化速率有何影响，哪些环境因素驱动该过程？ii）内部营养动态如何调节反硝化活性？iii）宿主营养策略如何影响反硝化速率？为评估这些问题，研究人员根据文献选取了一组营养策略不同的红海珊瑚，包括更依赖自养的虫黄藻珊瑚，如柱状珊瑚（Stylophora pistillata）、鹿角珊瑚（Acropora sp.）和千孔珊瑚（Millepora dichotoma），以及一种完全异养的、属于树珊瑚科（Dendrophylliidae）的不含虫黄藻珊瑚。研究人员每两个月采样一次，持续一整年，测量反硝化速率，评估各种生理参数并监测环境条件。研究人员假设珊瑚的反硝化速率在冬季低于夏季，因为低温会减缓细菌代谢。事实上，红海中部海草沉积物中已观察到这种反硝化活性模式，夏季速率高于冬季。其次，研究人员假设珊瑚宿主的内部营养动态会影响反硝化活性，因为已有研究发现反硝化活性与共生体细胞密度相关，提示与内部营养循环存在联系。最后，研究人员预期自养程度较高的珊瑚比异养程度较高的珊瑚表现出更高的反硝化速率。这一假设源于先前研究提示反硝化细菌可能依赖自养来源的碳。填补这些知识空白对于理解反硝化作用的自然动态以及环境压力（如海洋变暖和富营养化）对珊瑚微生物群落结构和功能的潜在影响至关重要。此外，这些发现将揭示反硝化作用的物种特异性差异，增强对特定物种如何抵御全球变化的理解。
在本研究中，研究人员提供了反硝化活性季节性的证据，春季/夏季的速率高于秋季/冬季。研究人员还发现反硝化途径受环境条件的高度影响，并识别出物种特异性的环境驱动因子。此外，研究人员发现反硝化细菌利用自养来源碳和环境碳共同驱动其代谢，其中属于树珊瑚科（Dendrophylliidae）的异养珊瑚的反硝化速率显著更高。
**结果**
**四种红海珊瑚的反硝化速率**
在全部四种红海珊瑚物种中均检测到反硝化活性（图1a）。全年平均而言，三种虫黄藻物种（S. pistillata、Acropora sp.和M. dichotoma）的反硝化速率相近，分别为0.09 ± 0.16、0.10 ± 0.16和0.08 ± 0.10 nmol N cm?2 h?1，彼此间无显著差异（p > 0.05；图1a）。然而，不含虫黄藻的树珊瑚科未定种（Dendrophylliidae indet）的平均反硝化速率显著高于三种虫黄藻物种（p < 0.05），为0.43 ± 0.61 nmol N cm?2 h?1，分别比S. pistillata和M. dichotoma高5倍，比Acropora sp.高4倍（图1a）。
**反硝化速率的季节变化**
四种物种的逐月反硝化速率在全年中均存在显著差异（Kruskal-Wallis检验；S. pistillata: H = 18.2, p < 0.01；Acropora sp.: H = 14.7, p < 0.05；M. dichotoma: H = 13.2, p < 0.05；Dendrophylliidae indet: H = 14.6, p < 0.01），整体呈现春季和夏季反硝化活性高于秋季和冬季的趋势（图1b–e）。在S. pistillata中，4月（0.20 ± 0.20 nmol N cm?2 h?1）和6月（0.23 ± 0.26 nmol N cm?2 h?1）的反硝化速率显著高于8月（0.02 ± 0.04 nmol N cm?2 h?1）、10月（0.03 ± 0.05 nmol N cm?2 h?1）、12月（0.01 ± 0.02 nmol N cm?2 h?1）和2月（0.05 ± 0.10 nmol N cm?2 h?1），所有p < 0.05（图1b）。在Acropora sp.中，6月（0.17 ± 0.10 nmol N cm?2 h?1）的速率显著高于10月（0.02 ± 0.03 nmol N cm?2 h?1）和12月（0.03 ± 0.04 nmol N cm?2 h?1），所有p < 0.05（图1c）。在M. dichotoma中，6月（0.18 ± 0.10 nmol N cm?2 h?1）的速率显著高于4月（0.05 ± 0.07 nmol N cm?2 h?1）和8月（0.03 ± 0.06 nmol N cm?2 h?1），所有p < 0.05（图1d）。最后，在Dendrophylliidae indet中，4月（0.89 ± 0.86 nmol N cm?2 h?1）和6月（0.69 ± 0.71 nmol N cm?2 h?1）的速率显著高于12月（0.02 ± 0.06 nmol N cm?2 h?1），所有p < 0.05（图1e）。
**光照与黑暗培养中的反硝化作用**
四种物种在逐月光照和黑暗培养条件下测得反硝化速率之间存在显著差异（图1b–e）。大多数反硝化速率测量值在黑暗培养中显著高于光照培养，在识别的13个显著配对中有11个呈现该趋势。具体而言，在S. pistillata中，4月黑暗条件下的反硝化速率比光照条件高23倍（Kruskal-Wallis, H = 6.00, p < 0.01），10月黑暗条件下为0.06 nmol N cm?2 h?1，而光照条件下为0 nmol N cm?2 h?1（Kruskal-Wallis, 5.54, p < 0.05；图1b）。在Acropora sp.中，6月黑暗条件速率高2倍（Kruskal-Wallis, H = 3.94, p < 0.05），8月黑暗条件比光照高39倍（Kruskal-Wallis, H = 6.99, p < 0.01）。10月黑暗条件下为0.05 nmol N cm?2 h?1，光照条件下为0 nmol N cm?2 h?1（Kruskal-Wallis, H = 5.54, p < 0.05；图1c）。在M. dichotoma中，6月黑暗条件速率高2倍（Kruskal-Wallis, H = 4.81, p < 0.05），10月黑暗条件比光照高8倍（Kruskal-Wallis, H = 6.90, p < 0.01；图1d）。最后，在Dendrophylliidae indet中，4月黑暗条件速率高17倍（Kruskal-Wallis, H = 6.99, p < 0.01），6月高7倍（Kruskal-Wallis, H = 5.77, p < 0.05），10月高53倍（Kruskal-Wallis, H = 6.21, p < 0.05），而8月黑暗条件下为0.06 nmol N cm?2 h?1，光照条件下为0 nmol N cm?2 h?1（Kruskal-Wallis, H = 7.76, p < 0.01；图1e）。然而，在13个显著配对中有2个观察到相反趋势，即光照培养中的反硝化速率高于黑暗培养。这仅在2月的Acropora sp.中观察到，光照条件比黑暗条件高382倍（Kruskal-Wallis, H = 7.26, p < 0.01），以及Dendrophylliidae indet中，光照条件下为0.3 nmol N cm?2 h?1，黑暗条件下为0 nmol N cm?2 h?1（Kruskal-Wallis, H = 7.20, p < 0.01；图1c, e）。
**反硝化作用环境驱动因子的确定**
研究人员将测得的环境变量（硝酸盐、铵、DOC、水体叶绿素a和温度）纳入随机森林模型，以确定各物种反硝化速率的最主要影响变量（图2）。环境变量解释的反硝化变异比例因物种而异：环境变量解释了S. pistillata反硝化变异的12%、Acropora sp.的57%、M. dichotoma的38%和Dendrophylliidae indet的50%。
在S. pistillata中，DOC、硝酸盐和铵被确定为影响反硝化速率的前三个最重要变量（图2a）。DOC可用性是S. pistillata反硝化作用的最强驱动因子（15% IncMSE），较高水平促进反硝化作用（图2b）。低硝酸盐可用性是S. pistillata反硝化速率的第二重要影响变量（12.5% IncMSE；图2a, c）。中等铵可用性也影响S. pistillata的反硝化速率，但程度较小（3.6% IncMSE；图2a, d）。在Acropora sp.中，温度、铵和水体叶绿素a对反硝化速率的影响最大且程度相近（图2e）。高温是Acropora sp.反硝化作用的首要驱动因子（14.4% IncMSE，图2e, f），其次是中等铵可用性（13.5% IncMSE，图2e, g）和水体叶绿素a（13.3% IncMSE；图2e, h）。在M. dichotoma中，反硝化速率受中等温度（13.6% IncMSE，图2i, j）、高DOC可用性（13.3% IncMSE，图2i, k）和中等水体叶绿素a浓度（13.3% IncMSE；图2i, l）的均衡影响。最后，在Dendrophylliidae indet中，低硝酸盐可用性是影响反硝化速率的最重要变量（21.1% IncMSE，图2m, n），其次是高DOC可用性（12.7% IncMSE；图2m, o）。高水体叶绿素a浓度（5.8% IncMSE，图2m, p）排名第三，但影响程度低于前两个变量。总体而言，每个物种受独特的环境变量组合影响。然而，研究人员也识别出多种物种共有的环境驱动因子，如DOC可用性和温度。
在对光照培养的反硝化数据重复随机森林分析后，研究人员发现光照不是任何物种反硝化作用的主要驱动因子（图S1）。但光照被识别为S. pistillata反硝化活性的次要驱动因子。
**内部营养动态对反硝化作用的影响**
在S. pistillata中，研究人员发现反硝化速率（0.09 ± 0.16 nmol N cm?2 h?1）与共生体δ13C（?14.16 ± 0.77‰；rho: 0.44；p < 0.05）之间存在显著正相关，与共生体δ1?N（2.55 ± 0.54‰；rho: ?0.45；p < 0.05；图3）之间存在显著负相关。在Acropora sp.中，研究人员发现反硝化速率（0.10 ± 0.16 nmol N cm?2 h?1）与宿主δ13C（?15.34 ± 1.03‰；rho: 0.44；p < 0.05）和共生体δ13C（?14.56 ± 0.48‰；rho: 0.51；p < 0.05；图3）之间存在显著正相关。在M. dichotoma中，未检测到反硝化速率与生物地球化学特征之间的显著关系（p > 0.05；图3）。此外，在Dendrophylliidae indet中，也未检测到反硝化速率与生物地球化学特征之间的显著关系（p > 0.05；图3）。然而，由于该不含虫黄藻物种不适用共生体相关参数，且其他参数样本量过少无法进行可靠分析，仅能分析一个关系（反硝化作用与宿主δ13C）（图3）。
**各珊瑚物种营养策略的确定**
研究人员使用适用于珊瑚的贝叶斯同位素生态位分析，结合Layman营养多样性指标，量化和比较了三种虫黄藻珊瑚S. pistillata、Acropora sp.和M. dichotoma的同位素生态位。三种物种表现出相似宽度的同位素生态位面积（图4a）。然而，M. dichotoma的宿主组分贝叶斯标准椭圆面积（SEAb）最大（2.87‰2，95% CI: 1.67–4.70），而S. pistillata为2.15‰2（95% CI: 1.31–3.51），Acropora sp.为1.34‰2（95% CI: 0.86–2.54）；M. dichotoma的共生体组分SEAb也最大（2.34‰2，95% CI: 1.14–3.18），而S. pistillata为1.05‰2（0.66–1.73），Acropora sp.为0.76‰2（CI: 0.38–1.18；图4b）。Layman指标也支持这一结果，M. dichotoma具有最大的NR、CR和TA（表1）。然而，M. dichotoma也具有最高的NND和SDNND（表1），表明样本间变异性较高。最后，当研究人员以宿主与共生体椭圆面积（经样本量校正的SEAc）之间的百分比重叠来量化异养与自养的相对依赖程度时，三种物种均表现出混合营养（mixotrophic）的摄食策略，平均SEAc无显著差异（图4c）。尽管样本量有限，重采样误差已稳定并收敛，而非跨越整个可能范围（0–100%），且各珊瑚物种的模式一致。因此，研究人员认为这些解释是保守且稳健的。
Dendrophylliidae indet的营养策略无法通过该方法量化，因为该分析需要宿主和共生体两个组分的同位素数据，而Dendrophylliidae indet缺乏共生体，该方法不适用。不过，作为不含虫黄藻的珊瑚，其摄食方式已知为完全异养。研究人员仍测量了Dendrophylliidae indet的宿主参数，平均宿主δ13C为?24.01 ± 2.08‰，高于S. pistillata（?14.72 ± 0.75‰）、Acropora sp.（?15.21 ± 0.60‰）和M. dichotoma（?15.3 ± 0.80‰；图S2）的平均宿主δ13C。遗憾的是，由于数据清洗后剩余样本量过少，宿主δ1?N无法可靠定量。
**讨论**
在四种珊瑚物种中，研究人员观察到反硝化活性的季节性模式，证明了该氮循环途径受环境条件的高度影响。此外，反硝化速率受珊瑚全息生物体内部营养动态的影响，并可能与珊瑚宿主的营养策略有关。
本研究中测得的反硝化速率经过适当换算后，与先前关于红海珊瑚研究的范围相当（图1a）。四种物种的速率在全年中也存在显著变化，总体呈现春/夏季高于秋/冬季的季节性趋势（图1b）。反硝化作用的季节性效应此前尚未在珊瑚中研究过，但河口和沼泽地等其他系统的研究报告了与本研究类似的季节性模式，发现春季反硝化速率更高，反硝化菌多样性也更高。这些先前研究和本研究中观察到的季节性趋势可归因于反硝化途径对全年波动的环境条件的敏感性（图S4）。
温度是Acropora sp.和M. dichotoma反硝化作用的主要驱动因子，但其影响在两种物种间存在差异。在Acropora sp.中，反硝化速率随温度线性增加。这一关系反映了较高温度刺激微生物代谢和活性的一般原理。红海海草沉积物中也观察到相同模式。此外，在珊瑚中，升高的温度会增加调控N?固定的固氮菌活性，引入更多可供反硝化作用的体内氮。R?decker等人的近期研究进一步表明，在高温下，珊瑚会分解代谢氨基酸，同样引入更多可供反硝化作用的体内氮。然而，对于M. dichotoma，反硝化速率在中等温度下达到峰值，在较高温度下则下降。这些差异可能反映了物种特异性反硝化微生物组的响应（及存在），正如先前在珊瑚之间的研究中所发现的。虽然没有文献直接比较Acropora sp.和M. dichotoma之间的反硝化微生物群落，但研究表明Acropora sp.比M. dichotoma拥有更高的细菌多样性，表明存在差异的可能性。
高DOC可用性被确定为S. pistillata反硝化作用的首要驱动因子，也是M. dichotoma和Dendrophylliidae indet的第二驱动因子。DOC与反硝化之间的正相关关系已在其他环境（如沉积物和淡水系统）中被广泛观察到，这归因于DOC作为支持异养微生物生长和活性的关键元素的角色。因此，本研究提供了证据表明珊瑚全息生物体中的反硝化细菌也能够利用环境DOC作为碳源，而非仅依赖共生体来源的碳。一项研究八放珊瑚反硝化作用中DOC影响的研究报告了相反的结果，过量DOC（以葡萄糖形式添加）使Xenia umbellata的反硝化菌丰度降低了一个数量级，但对Pinnigorgia flava没有影响。这一差异可能归因于DOC组成和浓度的变化。
与预期相反，低硝酸盐可用性是反硝化作用的另一个关键驱动因子。硝酸盐对反硝化过程至关重要，作为反硝化细菌的电子受体，被依次还原为氮气。因此，人们可能预期硝酸盐越充足，共生藻（在虫黄藻珊瑚中）吸收越多，反硝化速率越高。然而，本研究中观察到相反的关系，反硝化速率与低硝酸盐可用性相关（图2）。这可能仅仅是因为生态系统尺度上的反硝化活性足以降低周围水柱中的硝酸盐浓度。或者，El-Khaled等人的研究表明，氮循环是细微的，在较高环境氮条件下，N?固定和反硝化等对立途径会同时增加。在全年硝酸盐保持低水平（0.2–1.3 μmol L?1；图S4b）的寡营养红海中，N?固定可能响应低氮而升高，同时反硝化也增加。这表明反硝化仅在较高硝酸盐浓度下才占主导地位，而在较低浓度下可能与N?固定共存，如先前所发现的。然而，要完全解释这一发现，需要进一步研究反硝化和N?固定活性对一系列溶解无机氮浓度的响应。
此外，研究人员发现光照对反硝化活性的影响非常微妙。例如，在比较黑暗和光照培养之间的速率时，反硝化在黑暗条件下显著更高，仅有少数情况出现相反模式（图1b–e）。这可能反映了黑暗条件下氧气可用性的降低——光合作用停止而呼吸作用持续——创造了有利于厌氧微生物反硝化的条件。因此，本研究提供了证据表明反硝化在低氧条件下是更活跃的途径，与先前研究的发现一致。然而，尽管高光不是四种物种中三种的主要反硝化驱动因子，但相对于其他环境因子，光照成为S. pistillata反硝化作用的次要驱动因子（图S1）。这可以解释为光照条件下光合作用产生的更多有机碳为反硝化活性提供了燃料。综合来看，这些发现表明光照并非直接调控反硝化作用，而是通过影响珊瑚的代谢环境间接地促进或抑制反硝化活性。
虽然随机森林分析突出了反硝化作用的关键环境驱动因子，但本研究中的环境参数仍未能解释一部分反硝化变异性。例如，环境条件解释了S. pistillata反硝化变异的12%、Acropora sp.的57%、M. dichotoma的38%和Dendrophylliidae indet的50%（图2），强调了超出本研究范围的其他因素的潜在影响。
通过将反硝化速率与物种特异性生物地球化学特征相关联，研究人员在S. pistillata中发现反硝化速率与共生体δ1?N之间存在显著负相关（图3）。这表明反硝化可能增强或维持珊瑚全息生物体内的氮限制状态，正如预期的那样。然而，其他虫黄藻物种Acropora sp.和M. dichotoma中未观察到这一关系，这对反硝化在这些物种中的功能角色提出了挑战。此外，研究人员在Acropora sp.和S. pistillata中发现反硝化速率与共生体δ13C之间存在显著正相关，并在Acropora sp.中发现反硝化与宿主δ13C之间也存在显著正相关（图3）。这些发现提供了证据表明反硝化细菌利用自养来源的碳，与先前研究一致。当然，研究人员也提供了反硝化细菌利用环境DOC的证据（图2）。这自然引出宿主营养策略如何进一步影响反硝化活性的问题。
研究人员还考察了宿主营养策略对反硝化速率的影响。出乎意料的是，完全异养的Dendrophylliidae indet的反硝化速率显著高于本研究中的所有其他物种，分别比S. pistillata和M. dichotoma高5倍，比Acropora sp.高4倍（图1a）。这一结果与研究人员最初的假设相矛盾——基于先前研究的发现，研究人员曾预测自养程度较高的物种具有较高的反硝化速率。因此，研究结果表明，鉴于Dendrophylliidae indet中测得的异常高速率，环境碳甚至可能比光合碳更快地为反硝化提供燃料。然而，如此高的速率也可能归因于碳源之外的其他因素。例如，Dendrophylliidae indet可能拥有更多样化和高效的反硝化菌群落。研究人员还需要测量其他异养物种的反硝化活性，以判断这一发现是Dendrophylliidae indet特有的还是普遍适用于异养物种。此外，由于研究中的物种均为混合营养（图4），研究人员无法评估更偏自养的物种中的反硝化活性，建议未来研究纳入更依赖自养的物种。然而，由于样本量有限，研究人员不得不将同位素数据跨全年合并，可能错过了物种在季节间向更高自养程度的转变。因此，研究人员建议在每个季节时间点增加样本量。
此外，通过减轻过量氮，反硝化被认为可维持珊瑚全息生物体内的氮限制状态，这对珊瑚-藻类共生体的稳定性至关重要。然而，不含虫黄藻珊瑚中反硝化的存在对这一功能角色提出了挑战。研究结果表明，反硝化并非不含虫黄藻珊瑚的适应性特征，而是对环境条件组合的被动、机会性响应。这一解释与先前关于八放珊瑚和热带石珊瑚反硝化作用的研究一致。
在解决了研究的具体问题后，有必要在红海独特特征的背景下解释这些结果，以获得其生态相关性的更广阔视角。红海是地球上最温暖、最咸的海域之一，表现出强烈的时间和空间梯度。在空间上，温度、营养可用性和叶绿素a浓度在红海南北存在差异，南部温度、DIN和叶绿素a最高，向北递减，而浅水区营养可用性很低并随深度增加。本研究在红海中部浅水区进行，发现环境条件对反硝化活性有强烈影响。总体而言，温度和营养可用性是反硝化的关键驱动因子。基于研究结果，研究人员预计同一物种的珊瑚在红海不同区域可能因环境条件而表现出空间上的反硝化活性差异。例如，Acropora sp.的反硝化活性可能随温度和DIN的增加而向南增强。然而，将季节性发现外推到红海以外应谨慎，因为全球珊瑚礁区域的季节动态各不相同。一些区域如赤道印度-太平洋地区季节性较弱。因此，本研究中测得的春/夏季反硝化活性峰值可能不会在全球范围内出现。
**结论**
本研究表明，珊瑚中的反硝化途径具有季节性变化，春/夏季的速率普遍高于秋/冬季（图1b），这可归因于反硝化对环境条件的高度敏感性（图2）。研究识别出反硝化作用的物种特异性环境驱动因子（图2）。S. pistillata的首要驱动因子是DOC，提供了反硝化细菌并非 exclusively 依赖光合碳获取能量的证据（图2）。对于Acropora sp.和M. dichotoma，首要驱动因子是温度，但其影响在两种物种间存在差异（图2）。在Acropora sp.中，研究人员发现反硝化与温度之间存在线性关系，而在M. dichotoma中，反硝化活性随温度升高而增加，直至达到上限阈值后下降（图2）。对于Dendrophylliidae indet，研究人员意外地发现低硝酸盐可用性是反硝化的驱动因子（图2），但这可能是高反硝化活性的结果而非原因，或者是因为在低硝酸盐水平下反硝化与N?固定共存。研究还展示了光照对反硝化作用的微妙影响，发现光照通过影响珊瑚的代谢环境间接地促进或降低反硝化活性。此外，研究证明反硝化也受珊瑚全息生物体内部营养动态的影响，S. pistillata中反硝化与宿主δ13C之间的正相关关系，以及Acropora sp.中反硝化与宿主和共生体δ13C之间的正相关关系（图3），表明反硝化细菌利用共生体来源的碳，如先前研究所显示。最后，研究人员发现反硝化速率受宿主营养策略的影响，不含虫黄藻、完全异养的Dendrophylliidae indet中的反硝化显著更高，比S. pistillata和M. dichotoma高5倍，比Acropora sp.高4倍（图1a），而研究人员确定这些物种均为混合营养（图4）。这表明环境碳甚至可能比光合碳更快地为反硝化提供燃料，或者指向具有不同速率的独特反硝化菌群的影响。然而，在不含虫黄藻物种中测得的异常高反硝化速率挑战了氮去除的功能意义，因为没有珊瑚-藻类共生体需要这种调节。因此，研究人员推测反硝化在红海珊瑚中可能扮演比以前认为的更被动的角色，这强化了其他地理区域珊瑚相关反硝化研究和八放珊瑚研究的发现。总体而言，本研究为红海季节性反硝化速率及其四种物种环境驱动因子的理解建立了宝贵基线。这一基础为未来研究更详细地探索环境变化对氮循环的影响提供了跳板。
**材料与方法**
**珊瑚采集**
研究人员在红海中部位于沙特阿拉伯阿卜杜拉国王科技大学（KAUST）近海15公里处的“Al Fahal Reef”（又称“Coral Probiotics Village”，22.30518N, 38.96468E）进行珊瑚采集。采样区域较浅，最大水深10米。研究人员选取了四种营养策略不同的红海珊瑚，包括三种表现出混合营养摄食的虫黄藻物种S. pistillata、Acropora sp.和M. dichotoma，以及一种完全异养的不含虫黄藻珊瑚（属于Dendrophylliidae科）。研究人员使用SCUBA在水深1至5米处每两个月采样每个物种的五个独立群落（n = 5），在一整年时间跨度内共产生六个时间点，即2022年4月、2022年6月、2022年8月、2022年10月、2022年12月和2023年2月。采样始终在隔月的头两周内进行，第一周采集M. dichotoma和Acropora sp.，第二周采集S. pistillata和Dendrophylliidae indet。研究人员用钳子从每个群落切下三个片段，放入装有海水并贴有标签的采样袋中。三个片段中，两个用于培养实验（约5厘米长），一个用于同位素和元素分析（约5厘米长）。对于Dendrophylliidae indet，群落太小无法采集多个片段，因此每两个月采样15个珊瑚个体（polyps）。在船上，研究人员将用于培养的片段储存在装有采样点海水的循环水族箱中，配备气泵以维持水循环和氧气可用性。所有水族箱均置于阴凉处以防止运输过程中的热/光胁迫，用于生理评估的片段置于冰上，随后在实验室中于?20°C保存。采集工作由KAUST和不来梅大学合作开展，其中两个物种（S. pistillata和M. dichotoma）的部分数据集（同位素和元素数据）被单独分析。
**反硝化速率量化**
采样当天，研究人员通过乙炔阻断/抑制法量化反硝化速率。这种间接方法已成功应用于研究珊瑚礁相关反硝化活性。乙炔阻断反硝化途径中一氧化二氮（N?O）还原酶的活性，导致N?O积累，可作为珊瑚全息生物体反硝化相对活性的代理指标。乙炔法的有效性已在先前工作中得到验证，该工作同时使用乙炔法和nirS基因拷贝数进行反硝化定量。观察到的nirS基因丰度模式与乙炔法测得的反硝化速率密切对应，为乙炔法的准确性提供了证据。
为设置乙炔实验，研究人员用橡皮筋将每个珊瑚片段固定在支架上，放入气密玻璃烧杯中（图S3）。研究人员对烧杯进行了专门改造，在盖子上钻了一个8毫米的孔，用气密橡胶塞密封，并将一根皮下注射针（带聚丙烯鲁尔接口的30G × 3/4英寸皮下注射针，Tyco Healthcare集团，Monoject?）永久性地穿过塞子插入罐中。罐外，针座连接一个带鲁尔锁接口的双向旋塞阀（Braun? Discofix?双向旋塞阀），可在需要采集气体样品时安装气体注射器（50 ml气密注射器型号1050 TLL PTFE鲁尔锁，Hamilton）（图S3）。研究人员将每个烧杯
