《Molecular Psychiatry》：Lithium chloride in vitro treatment shows potential to rescue the neuronal phenotype caused by WDFY3 haploinsufficiency
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研究人员基于迄今报道的最大规模队列（n=32），对WDFY3功能缺失（loss-of-function，LoF）变异进行了全面的表型特征描述。研究结果界定了一种以神经精神特征（包括自闭症和注意力缺陷多动障碍，ADHD）、轻至中度神经发育迟缓以及可变的大脑生长表
研究人员基于迄今报道的最大规模队列（n=32），对WDFY3功能缺失（loss-of-function，LoF）变异进行了全面的表型特征描述。研究结果界定了一种以神经精神特征（包括自闭症和注意力缺陷多动障碍，ADHD）、轻至中度神经发育迟缓以及可变的大脑生长表现为标志的单基因疾病——其中最常见的是巨颅症，另有一例表现为头围减小。为探究WDFY3 LoF的影响，研究人员在人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y中进行了敲低（knockdown，KD）实验，并采用了Wdfy3单倍剂量不足小鼠模型。WDFY3 KD损害了蛋白聚集物的清除，并降低了泛素结合蛋白p62的蛋白水平。转录组分析鉴定出主要参与神经系统发育、神经元突起、MAPK/ERK1/2和WNT/β-catenin信号传导的基因网络失调，并在蛋白质水平得到验证。神经元细胞增殖增加，表现为细胞计数升高以及增殖标志物Ki-67和增殖细胞核抗原（PCNA）增加；相反，神经元细胞分化受损，表现为神经突生长减少。研究人员发现β-catenin下调，而GSK3B上调。氯化锂（LiCl）通过抑制GSK3B激活WNT/β-catenin信号传导，因此研究人员测试了LiCl处理，结果显著增加了WDFY3表达。此外，体外处理将Wdfy3单倍剂量不足神经元的神经突分支能力提高到超过野生型水平，尽管该特定效应似乎不依赖于WNT/β-catenin信号传导。总之，研究人员扩展了与WDFY3 LoF相关的表型，并利用体外人类和小鼠神经元模型提供了病理生理学见解。研究结果表明，LiCl可能作为携带WDFY3 LoF变异患者的一种潜在治疗策略。
WDFY3（WD repeat and FYVE domain-containing protein 3）编码一种自噬体支架蛋白，参与巨分子细胞组分（如聚集蛋白）的选择性招募和降解。WDFY3属于beige和CHS（BEACH）结构域蛋白家族，包含BEACH结构域、pleckstrin同源（PH）结构域、五个WD40结构域以及一个C端Fab1/YOTB/Vac1/EEA1（FYVE）结构域，该结构域促进其整合到囊泡膜中。WDFY3参与自噬和内吞等关键细胞过程，从无脊椎动物起在进化上高度保守，且广泛表达，提示其在维持正常细胞和机体功能中的重要作用。既往研究已发现WDFY3单倍剂量不足与脑体积增大及轻至中度神经发育迟缓（NDD）相关，但其在人类神经元中的具体影响仍不清楚。此外，WDFY3杂合缺失对神经元分化、信号通路失调及潜在治疗干预的机制尚未充分阐明。为此，研究人员开展了本研究，以进一步细化WDFY3 LoF的临床表型，并利用人类神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y敲低模型和Wdfy3杂合小鼠原代皮层神经元模型，系统探究WDFY3缺失的分子和细胞后果，并评估氯化锂（LiCl）作为潜在治疗策略的效果。该论文发表在《Molecular Psychiatry》。
研究人员首先通过国际合作队列（n=32）收集WDFY3截短变异病例，结合临床评估、头围测量和神经精神行为学数据，明确WDFY3 LoF相关表型谱。在机制研究中，采用siRNA介导的WDFY3敲低（KD）的SH-SY5Y细胞模型，通过RNA测序（RNA-seq）进行全基因组转录组分析，并通过基因本体（GO）富集分析识别失调通路。随后运用免疫印迹（Western blot）、免疫荧光染色、qPCR等技术验证WNT/β-catenin和MAPK/ERK1/2信号通路关键蛋白表达变化。细胞增殖通过细胞计数、Ki-67免疫荧光和PCNA基因表达评估；分化通过维甲酸诱导后神经突长度测量评估。为测试LiCl效应，研究人员对SH-SY5Y细胞及来自Wdfy3lacZ小鼠（C57BL/6NJ背景，KOMP品系）P0新生鼠和E13.5胚胎的皮层神经元进行5 mM LiCl处理，并采用Sholl分析量化神经元树突分支复杂度。此外，通过共转染表达Exon1Htt103Q-GFP的质粒评估选择性自噬功能。
结果部分：
**先证者临床特征**：32例WDFY3 LoF先证者（23男，9女）中，9例既往已报道，23例为新病例；变异均为杂合截短变异，分布于整个蛋白长度但均不在最后一个外显子。所有先证者均有NDD表现，24例有正式IQ数据者中16例（67%）为轻至中度智力障碍；24例有头围数据者中21例（88%）表现为巨颅或正常高值头围（>80百分位）。神经行为障碍常见：23/32（72%）诊断为自闭症谱系障碍（ASD），9/32（28%）有ADHD，2/32（6%）有强迫症（OCD）。4例遗传病例的父母症状轻微或缺失，提示外显率降低和临床表型可变。
**WDFY3敲低损害选择性自噬**：在SH-SY5Y细胞中共转染WDFY3 siRNA和Exon1Htt103Q-GFP质粒后，免疫染色和Western blot均显示WDFY3 KD细胞中聚集蛋白水平升高，且p62蛋白表达下降及p62斑点减少，表明自噬底物清除受损。
**转录组学分析**：WDFY3 KD后进行RNA-seq，鉴定出130个失调基因（padj<0.05）。GO富集分析显示“自主神经系统发育”、“轴突发生”、“轴突发育”和“细胞生长”等通路受影响；信号通路分析发现WNT/β-catenin、MAPK/ERK1/2和NOTCH信号通路相关基因下调。
**WNT/β-catenin及MAPK/ERK1/2通路失调**：WDFY3 KD后24小时，β-catenin蛋白显著降低（0.794±0.112倍，p=0.023），GSK3B基因表达上调（1.182±0.1倍，p=0.008）；转染5天后总ERK1/2蛋白显著升高（1.67±0.336倍，p=0.023）。转录组中CTNNB1下调、AXIN2上调，但未观察到其他核心WNT组分或dishevelled蛋白的改变。
**WDFY3敲低导致增殖增加和分化降低**：WDFY3 KD组培养4天后细胞数显著增加（1.438±0.255倍，p=0.01），Ki-67阳性细胞比例升高（1.129±0.053倍，p=0.011），PCNA表达呈升高趋势（p=0.065）。经维甲酸分化5天后，WDFY3 KD细胞神经突长度显著缩短（0.736±0.101倍，p=0.005）。
**WDFY3在分化及LiCl处理后表达上调**：分化SH-SY5Y细胞中WDFY3表达较未分化细胞高2.672±0.866倍（p=0.018）。5 mM LiCl处理24小时显著增加WDFY3、AXIN2和GSK3B基因表达；15分钟处理即可检测到GSK-3β Ser9磷酸化增加。在Wdfy3lacZ P0皮层神经元中，LiCl处理8天使野生型Wdfy3表达增加9.027±4.403倍，杂合细胞增加100.515±182.895倍。
**LiCl增强Wdfy3杂合皮层细胞树突分支**：E13.5胚胎皮层神经元经5 mM LiCl处理8天后，杂合神经元的树突分支显著增加，在距胞体15–55 μm处交点数量超过未处理杂合组，在10–20 μm处超过未处理野生型；处理后杂合细胞的树突分支甚至超过野生型未处理水平。LiCl处理对野生型神经元无显著影响。
**讨论与结论**：研究人员在总结部分指出，WDFY3 LoF导致神经精神障碍、NDD及脑大小改变。在细胞水平表现为增殖增加、分化减少及神经突分支降低，这些效应可能由失调的信号通路（尤其是WNT/β-catenin和MAPK/ERK1/2通路）介导。LiCl处理能够提高WDFY3表达，并显著增强Wdfy3单倍剂量不足神经元的树突分支和神经突生长，尽管该作用可能并非主要通过经典β-catenin稳定化实现，提示其他GSK3β底物或平行信号通路参与其中。LiCl已用于治疗双相情感障碍和抑郁症，并获批用于儿童，因此可能为携带WDFY3 LoF变异的患者提供潜在治疗选择。研究人员强调结果仍属初步，未来需设计研究进一步验证LiCl的临床治疗潜力。
