腙交联透明质酸-海藻酸水凝胶支持V2a中间神经元的生成与成熟

《Journal of Materials Chemistry B》：Hyaluronic acid–alginate hydrazone crosslinked hydrogels support the generation and maturation of V2a interneuronsOpen Access

　　

中枢神经系统（CNS）损伤会引起炎症、细胞死亡和胶质瘢痕形成，从而抑制组织修复。经细胞外基质（ECM）衍生肽修饰的可注射水凝胶能够提供促进神经组织修复的生化信号，并可作为载体以微创方式将治疗药物递送穿过血-脊髓/血-脑屏障。研究人员开发了一种用于神经组织修复的可注射腙交联透明质酸-海藻酸（HA–Alg）水凝胶。研究人员制备了一系列不同聚合物浓度的水凝胶，并评估了其理化性质，以确定能够模拟CNS组织环境的刚度和黏弹性特性的配方。进一步将透明质酸与ECM来源的细胞粘附肽（RGD和IKVAV）进行修饰，以增强神经元的粘附和存活。为评估该水凝胶平台的治疗潜力，研究人员包埋小鼠胚胎干细胞聚集体，并诱导其向成熟V2a中间神经元分化。这类中间神经元对于传递运动信号至关重要，是治疗脊髓损伤极具前景的治疗性细胞群体。研究人员证实，在含有ECM衍生肽的HA–Alg水凝胶中，V2a中间神经元成功富集，Chx10表达较层粘连蛋白对照组增加了2倍。有趣的是，研究人员新描述的HA–Alg水凝胶以及已建立的含有IKVAV肽的交联HA–HA水凝胶，与不含肽的水凝胶相比，均显著增加了中间神经元富集培养物中的神经突长度，HA–IKVAV + HA的平均长度约为197.2 ± 53.5 μm，HA–IKVAV + Alg的平均长度约为212.4 ± 75.2 μm。该研究表明，含有ECM衍生肽的仿生水凝胶平台能够支持神经元粘附和存活，为未来在功能性CNS组织修复中的应用奠定了基础。

论文解读：腙交联透明质酸-海藻酸水凝胶支持V2a中间神经元的生成与成熟

一、研究背景与科学问题

脊髓（spinal cord）在传递感觉信息至大脑的同时，负责将运动指令传回外周神经系统。脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）以神经元退行性变为特征，可导致运动、感觉和自主神经功能障碍。损伤后，免疫细胞快速浸润和放射状胶质细胞活化形成炎症微环境，引发继发性组织损伤、组织缺损空腔以及胶质瘢痕的形成，后者从物理和生化两个层面抑制组织再生。尽管已有多种治疗策略在啮齿动物模型中显示出促进神经再生的效果，但临床转化率极低。这种转化失败可能源于临床损伤的异质性、多厘米囊性空腔的形成，以及比典型啮齿动物挫伤模型严重得多的生长屏障。水凝胶、纳米颗粒和取向支架等生物材料有望克服这些障碍，因为它们可以被设计为支持活细胞的局部递送、生物活性蛋白的持续释放，以及整合其他可改善损伤微环境的生物分子。

水凝胶若能模拟CNS细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的力学特性，包括100–1000 Pa的刚度范围、细胞粘附性和黏弹性，则可支持细胞增殖和分化并引导轴突延伸。透明质酸（hyaluronic acid, HA）是CNS中含量最丰富的ECM分子，可通过增强神经祖细胞和少突胶质祖细胞的迁移、增殖和分化来维持神经组织稳态。然而，HA水凝胶虽在临床前研究中表现出良好前景，但HA本身缺乏支持神经元附着和增殖所必需的粘附信号。海藻酸（alginate）是一种来源于褐藻的天然多糖，具有抗氧化、抗炎和神经保护特性，但传统钙离子交联的海藻酸水凝胶在CNS应用中受到限制，因为钙离子交换可引发炎症反应，且在离子强度较高的CNS环境中易溶胀或变硬。

V2a中间神经元是兴奋性细胞，横跨后脑和脊髓，是感觉运动信息在节段间传递的关键桥梁，参与交感神经和副交感神经功能的协调。在脊髓内，这些神经元协调对自主和随意运动功能至关重要的兴奋性输入。V2a中间神经元的消融会破坏小鼠的呼吸模式、前肢抓取任务和左右后肢协调。已有研究证明，将V2a中间神经元移植到大鼠颈脊髓损伤模型中，其能与宿主脊髓功能整合，改善电生理信号并恢复膈肌活动。然而，在较大的损伤中，移植神经元的体内存活和植入面临挑战，因为慢性炎症、胶质瘢痕的生长抑制环境以及缺乏细胞粘附底物均可导致细胞死亡。虽然含星形胶质细胞来源ECM的HA水凝胶已成功用于V2a中间神经元的移植，但与单独HA水凝胶相比，该系统中损伤区域的神经元突起并未显著增强，这可能是由于HA本身缺乏支持神经元附着和增殖所需的粘附信号。因此，亟需开发具有细胞粘附信号的水凝胶，以支持移植神经元的存活和植入。

二、研究目的与假设

针对上述挑战，研究人员描述了一种双聚合物透明质酸-海藻酸（HA–Alg）腙交联水凝胶，用于支持V2a中间神经元的存活、分化和成熟，以促进神经组织修复。研究人员假设，通过动态共价交联结合HA和海藻酸特性的水凝胶能更精确地模拟CNS组织的生物力学特性，并消除对钙基交联剂的需求。HA经己二酸二酰肼（ADH）功能化，与氧化海藻酸交联形成可逆腙键。这种动态共价交联能够制备具有剪切变稀和自愈合特性的可注射水凝胶，可通过血-脊髓/血-脑屏障以微创方式注射填充组织缺损空腔。此外，研究人员还假设，将纤连蛋白来源的RGD肽和层粘连蛋白来源的IKVAV肽化学缀合到HA上，可提供具有适当生化信号的粘附底物，以支持V2a中间神经元的培养。

三、技术方法与实验设计

该研究首先对HA进行降冰片烯修饰（HA–Nor），再通过EDC/HoBt偶联反应连接己二酸二酰肼（HA–Nor–ADH），同时将海藻酸钠经高碘酸钠氧化为氧化海藻酸（Alg–Ox），暴露醛基以供交联。通过光引发的硫醇-烯点击化学反应，将末端含半胱氨酸的RGD（CGRGDSG）和IKVAV（CGKIKVAVG）肽缀合至HA。采用核磁共振氢谱（1H NMR）表征HA–Nor和HA–Nor–ADH的修饰度，通过羟胺盐酸盐滴定法测定Alg–Ox的氧化修饰度，并使用Ellman试剂检测巯基消失以定量肽缀合效率。水凝胶的理化表征包括倒置试管法测定凝胶化时间、流变仪压缩测试测定压缩模量、28天质量变化测定溶胀与降解行为、注射性测试、剪切变稀流变测试、扫描电子显微镜（SEM）孔径分析。细胞实验采用AB2.2小鼠胚胎干细胞系（mESCs），经聚二甲基硅氧烷（PDMS）微孔板形成拟胚体（EBs）后包埋于不同水凝胶配方中，采用维甲酸（RA）、普莫啡胺（Pur）和DAPT进行V2a中间神经元定向分化。通过活/死染色评估细胞活力，免疫细胞化学染色检测βIII-微管蛋白（TUBB3）并进行神经突长度分析，实时定量PCR（qPCR）检测Chx10、Slc17a6、Mapt和Ppia等标志基因的表达。所有实验均独立重复三次（N = 3）。

四、研究结果

1. 聚合物修饰与HA–Alg水凝胶的合成

海藻酸经氧化后平均醛基修饰度为61.26 ± 8.82%，平均产率为72.65 ± 10.93%。HA的降冰片烯平均修饰度为4.75 ± 2.21%，平均产率为42.77 ± 1.93%。HA–Nor–ADH的ADH平均修饰度为37.50 ± 5.71%，平均产率为65.19 ± 5.29%。IKVAV在聚合物上的平均缀合浓度为12.69 ± 6.10 nmol mg?1 HA，RGD为14.27 ± 7.55 nmol mg?1 HA。该结果表明各步化学修饰均成功完成，为后续水凝胶交联和肽功能化奠定了基础。

2. HA–Alg水凝胶的理化性质表征

通过改变HA与海藻酸浓度（1–3% w/v）制备了系列水凝胶。所有水凝胶均在5分钟内凝胶化，但HA1.0Alg1.0、HA1.0Alg2.0和HA2.0Alg1.0配方的凝胶时间超过5分钟。压缩模量随聚合物浓度增加而升高，其中HA3.0Alg3.0是唯一压缩模量超过100 Pa的配方，达130.3 ± 9.6 Pa。质量变化实验表明，水凝胶在PBS和人工脑脊液（aCSF）中的稳定性随聚合物浓度偏离等化学计量比而下降，高海藻酸配方在aCSF中稳定性较差。HA3.0Alg3.0配方的凝胶化时间为1.2 ± 0.3分钟，满足1–5分钟的目标窗口，虽然前14天质量损失超过25%，但在28天时恢复到±25%以内。3% w/v HA–Alg与HA–HA水凝胶均表现出剪切变稀特性和可注射性，两种水凝胶的孔隙率无统计学差异。

3. HA–Alg水凝胶支持V2a中间神经元活力

活/死染色定量分析表明，未经修饰的HA + Alg水凝胶（54.9 ± 2.6%）和RGD修饰的HA–RGD + HA（50.0 ± 7.7%）、HA–RGD + Alg（52.7 ± 1.4%）中细胞活力显著低于2D层粘连蛋白对照（91.4 ± 6.0%）。相比之下，IKVAV修饰的HA–IKVAV + HA（77.1 ± 7.2%）和HA–IKVAV + Alg（72.4 ± 20.9%）水凝胶中细胞活力与层粘连蛋白对照相当，表明层粘连蛋白来源的IKVAV肽对于维持3D细胞活力至关重要。

4. V2a中间神经元分化效率评估

qPCR分析显示，与水凝胶包埋细胞相比，所有水凝胶配方均促进了V2a中间神经元标志物Chx10以及成熟神经元标志物Mapt和Slc17a6相对于2D层粘连蛋白对照的上调。不同水凝胶配方之间Chx10和Slc17a6的表达无统计学显著差异，表明驱动分化的可溶性小分子能够有效扩散穿过3D聚合物网络，早期谱系定型主要由可溶性培养基信号而非基质固定的粘附信号驱动。

5. IKVAV修饰水凝胶增强神经突向外生长

免疫细胞化学染色显示，包埋于未修饰水凝胶（HA + HA和HA + Alg）中的EB形成致密且形态受限的球体，无明显的向外神经突延伸。RGD修饰水凝胶（HA–RGD + HA和HA–RGD + Alg）未能克服这种物理限制，TUBB3染色显示缺乏细胞骨架延伸。相反，IKVAV修饰水凝胶（HA–IKVAV + HA和HA–IKVAV + Alg）中的EB表现出明显的形态成熟，TUBB3阳性神经突径向投射至周围3D水凝胶空间。定量分析显示，HA–IKVAV + HA水凝胶中平均神经突长度为197.2 ± 53.5 μm，HA–IKVAV + Alg为212.4 ± 75.2 μm，与2D层粘连蛋白对照（232.3 ± 25.6 μm）相当，而RGD修饰和未修饰水凝胶中无显著的神经突延伸。

五、讨论与结论

研究结果表明，HA3.0Alg3.0配方实现了约100 Pa的压缩模量，与天然CNS组织的刚度范围一致。文献报道较软的基质（约100–500 Pa）有利于神经发生和神经突生长，而较硬的基质则驱动神经祖细胞向胶质谱系分化。凝胶化动力学方面，1.2分钟的快速凝胶化确保了细胞在3D空间中的均匀悬浮。与依赖钙离子交联的传统海藻酸水凝胶相比，该研究采用的共价腙键水凝胶在富含离子的aCSF中具有更好的长期稳定性。HA–Alg与HA–HA水凝胶的细胞相容性无显著差异，证实海藻酸可作为神经细胞培养的可行共聚物。

讨论中研究人员特别强调了生化分化与形态成熟之间的解耦现象：所有水凝胶配方均能通过可溶性信号高效驱动V2a中间神经元的转录分化，但结构成熟和神经突延伸需要特定的ECM衍生肽。尽管RGD作为通用细胞粘附基序在某些3D微环境中能支持神经分化和神经突延伸，但本研究中RGD修饰水凝胶的形态成熟高度可变且不如IKVAV功能化水凝胶稳健。这可能与本研究中较低的肽浓度有关——该研究获得的水凝胶中IKVAV浓度约0.38 ± 0.18 mM、RGD约0.43 ± 0.23 mM，低于文献中常见的2–6 mM。IKVAV模拟CNS中丰富的天然层粘连蛋白ECM，通过神经特异性受体参与真正的微管组装，可能只需要较低浓度的缀合肽即可产生强烈的形态学响应。V2a中间神经元对微环境高度敏感，需要层粘连蛋白来源的ECM识别信号来实现成熟。

研究结论：研究人员成功构建了一种可注射的、腙交联的HA–Alg水凝胶，满足神经元培养的复杂理化与生化要求。研究发现V2a中间神经元在3D微环境中的生化分化与形态成熟存在根本性解耦：分化小分子可有效渗透所有水凝胶配方，驱动Chx10阳性V2a中间神经元的转录分化，而结构成熟则需要生化粘附信号。层粘连蛋白来源的IKVAV肽修饰将基质转化为高度允许性支架，维持细胞活力并驱动广泛的神经突生长。HA–Alg复合水凝胶在促进结构成熟方面优于同类的HA–HA网络，凸显了混合聚合物体系的优势。HA–IKVAV + Alg水凝胶代表了一种高度可调、仿生的平台，能够克服干细胞聚集体在水凝胶中包埋的物理限制，为未来通过移植细胞促进SCI后功能再生提供了一种有前景的微创策略。