《Journal of Biological Chemistry》：Stress-induced helicase DHX36 controls neuroinflammation
编辑推荐：
摘要翻译：在衰老过程中，大脑神经元长期承受炎症、蛋白质稳态和基因毒性应激，并伴随G-四链体（G4s）等非经典核酸结构的累积。研究人员利用G4结合探针和质谱技术，在老年小鼠脑中鉴定到G4解旋酶DHX36富集，进而探讨其在衰老过程中的调控机制。DHX36在老年小鼠
摘要翻译：在衰老过程中，大脑神经元长期承受炎症、蛋白质稳态和基因毒性应激，并伴随G-四链体（G4s）等非经典核酸结构的累积。研究人员利用G4结合探针和质谱技术，在老年小鼠脑中鉴定到G4解旋酶DHX36富集，进而探讨其在衰老过程中的调控机制。DHX36在老年小鼠和人脑神经元中表达升高，并在tau蛋白病小鼠模型和阿尔茨海默病（AD）脑中进一步上调。出乎意料的是，使用吡啶司他汀（PDS）药理学稳定G4后，培养的小鼠皮层神经元中Dhx36 mRNA和蛋白水平降低，表明单纯G4稳定不足以诱导DHX36表达。相反，与衰老相关的应激因素（包括炎症、内质网应激和基因毒性应激）可显著上调培养神经元中DHX36表达及核内G4阳性斑点。神经元转录组分析显示，DHX36抑制神经炎症通路，并调节与炎症、衰老和染色质调控相关的基因。DHX36下调染色质结构因子Hmga1和Hmga2，确定其为下游靶标。ATP酶缺陷型DHX36突变体（E335A）可再现野生型DHX36的主要转录效应，表明这些效应不依赖ATP依赖性解旋。上述发现将DHX36鉴定为一种应激响应性G4解旋酶，连接衰老相关应激与神经元转录调控，并提示其在衰老和神经退行性病变中维持神经元稳态的作用。
论文解读：
**研究背景与问题**：核酸除经典双螺旋外，可形成G-四链体（G4s）、i-motif、三链DNA和R-loop等多种二级结构。G4s是由富含鸟嘌呤的DNA或RNA区域通过Hoogsteen氢键和G-四分体堆叠形成的四链结构，广泛存在于启动子、增强子、端粒和非翻译区等调控区域，影响转录、染色质组织和RNA代谢。细胞内G4水平受G4结合蛋白和G4解旋酶动态调控。尽管G4在癌症中已被广泛研究，但在衰老大脑中的调控机制知之甚少。G4解旋酶与衰老密切相关，WRN、BLM、FANCJ、RTEL1和RECQL4等解旋酶突变可导致早衰综合征，伴有染色体不稳定、细胞早衰和加速衰老。多种解旋酶还具有不依赖ATP酶活性的功能，如RECQL5可直接结合RNA聚合酶II抑制转录，DDX5/DDX17通过结合HDAC1调控转录等。然而，G4解旋酶在衰老过程中的作用、剂量敏感性及应激响应性调控仍不清楚。本研究旨在鉴定衰老大脑中富集的G4解旋酶，并阐明其上游调控信号及下游转录效应。
**研究内容与结论**：研究人员利用G4亲和质谱技术，在老年小鼠皮层裂解物中鉴定到DHX36富集，并验证了其在老年小鼠和人脑皮层及海马神经元中的表达升高，在PS19 tau蛋白病小鼠和阿尔茨海默病（AD）脑组织中进一步上调。为明确上游触发因素，研究人员检测了单纯G4稳定化对DHX36的影响，发现PDS处理虽增加G4阳性结构，却降低Dhx36 mRNA和蛋白水平，表明单纯G4稳定不足以诱导DHX36。随后测试了衰老相关应激的作用，发现促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IFN-γ）、内质网应激（衣霉素、毒胡萝卜素）和基因毒性应激（依托泊苷）均显著上调Dhx36 mRNA和蛋白水平，并增加G4阳性斑点。为确定DHX36影响的转录程序，研究人员在原代皮层神经元中过表达DHX36并进行RNA测序，发现DHX36改变神经元转录组，抑制炎症通路，调节衰老、衰老相关和染色质调控基因，并下调HMGA1和HMGA2。ATP酶缺陷型DHX36突变体（E335A）可再现野生型DHX36的主要转录效应，表明这些效应不依赖ATP依赖性解旋。该研究将DHX36鉴定为应激响应性G4解旋酶，连接衰老相关应激与神经元转录调控，提示其在衰老和神经退行性病变中维持神经元稳态的潜在作用。
**关键技术与方法**：研究使用了G4亲和质谱（G4-affinity mass spectrometry）从年轻（3月龄）和老年（26月龄）雄性小鼠额叶皮层裂解物中鉴定与G4-DNA寡核苷酸（ATG2700）结合的蛋白；采用免疫组织化学和免疫细胞化学结合共聚焦显微镜检测DHX36、HMGA1/2的表达和G4斑点（通过BG4抗体和N-TASQ探针）；使用慢病毒载体在原代皮层神经元中过表达mScarlet标记的野生型DHX36或E335A突变体；通过RNA测序（RNA-seq）和后续生物信息学分析（KEGG通路、GO富集）鉴定差异表达基因；采用RT-qPCR和JESS毛细管免疫分析验证mRNA和蛋白水平变化。人脑组织样本来自BRAINS Research Lab脑库，包括年轻对照（n=12）、老年对照（n=15）和AD患者（n=13）的海马CA3区组织。
**研究结果**：
**1. G4解旋酶DHX36在老年小鼠脑中富集**：通过G4-DNA探针pull-down结合质谱分析，发现DHX36在老年脑裂解物中相比年轻脑显著富集，且为所有检测蛋白中倍数变化最大的G4结合蛋白。免疫染色进一步证实，与年轻（4月龄）相比，老年（24月龄）小鼠皮层和海马神经元中DHX36表达显著升高，且雄性和雌性均如此。
**2. DHX36在PS19小鼠和AD人脑中表达增加**：在tau蛋白病模型PS19小鼠（22-24月龄）皮层和海马神经元中，DHX36表达显著高于年龄匹配的野生型对照；雌性PS19小鼠海马中DHX36水平高于雄性。人脑CA3区分析显示，老年个体DHX36表达高于年轻个体，AD患者脑中进一步升高，且女性AD患者高于男性。RT-qPCR和JESS实验在转录和蛋白水平验证了上述结果。
**3. G4稳定化不上调神经元中的DHX36表达**：PDS处理2 μM 24小时后，神经元中DHX36蛋白和mRNA水平均显著降低，表明单纯增加G4负载不能诱导DHX36表达，与老年和AD脑中DHX36升高的现象形成对比。
**4. 应激相关信号上调DHX36表达并增加神经元G4阳性斑点**：促炎细胞因子（TNF-α、IL-1β、IFN-γ）、内质网应激诱导剂（衣霉素、毒胡萝卜素）和DNA损伤剂（依托泊苷）处理均显著增加DHX36 mRNA和蛋白水平，并促进核内G4斑点形成（通过N-TASQ和BG4两种探针验证）。这表明DHX36诱导与信号活跃的应激条件相关，而非单纯G4稳定化。
**5. DHX36调节神经元转录**：RNA-seq分析显示，DHX36过表达导致286个差异表达基因（DEGs），其中69个上调、217个下调。富集分析显示涉及细胞因子-细胞因子受体相互作用、IL-17信号、NF-κB信号、TNF信号、PI3K-AKT信号、MAPK信号、p53信号、细胞衰老和凋亡等通路。DHX36主要发挥基因抑制作用，作为炎症和应激相关转录程序的负调控因子。
**6. DHX36改变免疫应答基因**：DHX36调节73个免疫相关基因，其中66个下调、7个上调。显著下调的基因包括CXCL家族（Cxcl1、Cxcl2、Cxcl5、Cxcl10）、Bcl3、Tlr2、Foxf1、Gbp2、Cd14、Cd44、Myd88、Ddx60和Parp14；上调基因包括Il23r、Pagr1a、Defb11、Gpr17、Npb和Ulbp1。RT-qPCR验证了Cxcl1、Casp4、Il19、Tlr2、Bcl3、Serpine1、Cd14和Myd88的显著下调，以及Pagr1a和Gpr17的上调。DHX36负调控Myd88，该蛋白是Toll样受体和IL-1受体下游炎症通路的关键接头分子。
**7. DHX36影响凋亡、铁死亡和衰老相关基因**：DHX36调控凋亡过程（GO:0006915）相关基因中7个上调、44个下调。上调基因包括促凋亡因子Bmf；下调基因包括Bcl2a1a、Casp4、Il19、Bcl3、Birc3、Sphk1、Unc5b等，其中Casp4与内质网应激诱导的凋亡和β-淀粉样蛋白诱导的细胞死亡相关。铁死亡相关基因Cp、Slc39a14和Slc7a11被下调。衰老相关基因Gadd45b、Serpine1、Cdkn2b和Igfbp3也被下调。
**8. DHX36改变高迁移率族蛋白HMGA1和HMGA2的表达**：RNA-seq显示DHX36下调Hmga1和Hmga2，二者编码非组蛋白染色质结合蛋白，维持开放的转录许可性染色质状态，促进炎症和衰老相关基因表达。免疫细胞化学和JESS实验证实DHX36过表达降低核内HMGA1和HMGA2蛋白水平。在老年（24月龄）小鼠皮层和海马中，HMGA1和HMGA2蛋白水平较年轻（4月龄）小鼠显著降低，雌性海马中HMGA1降低更明显。
**9. DHX36靶基因的抑制不依赖ATP酶活性**：ATP酶缺陷型DHX36（E335A）过表达导致462个基因差异表达（117个上调、345个下调）。野生型DHX36调控的286个基因中，203个（71.0%）也被E335A显著调控，富集倍数达28倍（超几何检验P < 1 × 10?1??）。两种构建体的倍变变化高度相关（Pearson r = 0.83，P = 3.4 × 10???），且99.3%基因变化方向一致。炎症和衰老相关靶基因（Cxcl1、Casp4、Il19、Tlr2、Bcl3、Serpine1、Cd14、Myd88、Pagr1a、Gpr17）在野生型和E335A中表现相似，RT-qPCR验证了相同方向的变化。这表明DHX36的主要转录效应不依赖ATP依赖性解旋。
**讨论与结论**：本研究表明，DHX36在神经元中的表达受小分子G4稳定化与衰老相关细胞应激的差异性调控。衰老相关的慢性应激（炎症、蛋白质稳态和基因毒性）增加Dhx36转录和蛋白水平，而PDS仅增加G4斑点却降低DHX36，说明DHX36并非由G4稳定直接诱导，而是在衰老相关应激条件下被诱导。DHX36升高改变神经元转录组，主要抑制免疫和炎症通路，下调HMGA1/2和衰老相关基因，且这些效应不依赖ATP酶活性，符合多种解旋酶具有非催化功能的一般规律。DHX36在免疫细胞和神经元中的功能具有细胞类型依赖性：在免疫细胞中促进免疫信号，在神经元中抑制过度炎症反应。DHX36-HMGA1/2关系可能连接持续性细胞应激与老年神经元表观遗传重塑。雌性和雄性在DHX36表达上的差异提示性别依赖性调控。该研究将DHX36鉴定为应激响应性调节因子，连接细胞应激与神经元转录控制和神经炎症信号，为理解衰老和神经退行性疾病中的G4稳态和炎症调控提供了新视角。未来需阐明上游信号通路、DHX36的染色质结合和功能机制，并通过体内研究验证其生理功能。
