脉冲不分流进样与低温聚焦技术在SPME-GC–MS挥发性有机物分析中的应用研究

《Journal of Chromatography A》：Effect of pulsed splitless injection and cryogenic focusing on the analysis of volatiles by SPME-GC–MS

　　

摘要专业翻译 固相微萃取（SPME）结合不分流进样分析低沸点分析物可能导致分裂峰或多峰现象。SPME配合不分流进样需要在色谱柱入口处进行额外的聚焦处理。低温聚焦（Cryofocussing）对于获得尖锐且窄的色谱峰、最大化峰容量是必要的。脉冲不分流进样（Pulsed splitless injection）可提高进样口压力，从而增加分析物的转移效率。脉冲不分流进样结合低温捕集（cryotrapping）可获得最佳的前期色谱峰响应和分辨率。本研究以Swartzia simplex花朵和Lavandula angustifolia精油为挥发性基质，系统考察了脉冲压力值与低温捕集单独及联合使用时的效果，并探讨了其与样品转移率、峰形（对称性）、色谱图峰容量、方法灵敏度、色谱分辨率和质谱质量之间的关系。结果表明，低温聚焦可显著提高色谱峰的高度和窄度，增加峰容量和分离效率，同时改善质谱匹配质量。在35 psi脉冲压力下联合低温捕集，样品转移率较常规不分流进样最高提升约1.66倍，检测灵敏度显著提高。该方法为痕量挥发性有机化合物（VOCs）的定性和定量分析提供了高灵敏度、高分辨率的稳健工具，在活性气味成分鉴定及生物标志物检测等领域具有广阔应用前景。

论文解读

一、研究背景与意义

挥发性有机化合物（VOCs）的分析在环境监测、食品风味研究、植物化学和临床诊断等领域具有重要应用。气相色谱-质谱联用（GC–MS）是分析可汽化化合物的首选技术，然而并非所有进样模式都能实现样品向色谱毛细管柱的完全转移。不分流进样虽最接近定量转移，但仍存在多种歧视效应，包括进样速度、进样室温度和压力、衬管内体积与形状、样品溶剂性质以及载气流速等因素的影响。更重要的是，不分流进样可能导致时间性谱带展宽，产生畸变的色谱峰形，这一进样环节常被称为气相色谱的“阿喀琉斯之踵”。

根据美国环境保护署（EPA）的分类，极挥发性有机化合物（VVOCs）沸点范围在<0°C至50–100°C之间，对应正构烷烃C4至C6，线性保留指数（LRI）为400至600；挥发性有机化合物（VOCs）沸点范围在50–100°C至240–260°C之间，对应C6至C14，LRI为600至1400。对于VVOCs，由于没有机制能在毛细管柱起始端完全捕获分析物，常出现变形峰、较差的检测限以及与其他溶质的共流出，导致定性定量不准确。虽然低初始柱温常用于捕集，但往往不足以使高挥发性分析物在柱头完全冷凝。Grob不分流进样技术利用共注入溶剂辅助冷凝和捕集效应，但SPME无溶剂进样方式恰恰缺乏这一条件。

针对上述问题，本研究旨在探索脉冲不分流进样结合低温捕集（CT）系统在SPME-GC–MS分析VVOCs和VOCs中的应用效果，以解决常规不分流进样中高挥发性分析物峰形畸变、转移率低和灵敏度不足等瓶颈问题。

二、研究设计与技术方法

研究人员以Swartzia simplex花朵和Lavandula angustifolia精油为两种不同的挥发性基质样本。花朵样本采集自巴西里约热内卢植物园，精油样本购自BioEssência（巴西里约热内卢）。采用三相结合型固相微萃取（SPME）纤维（二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷，DVB/CAR/PDMS）进行顶空萃取，花朵样本在40°C下萃取30分钟，精油样本在30°C下萃取30秒。GC–MS系统采用Agilent 6890N气相色谱仪配Agilent 5973N四极杆质谱仪，DB-5毛细管柱（30 m × 0.25 mm × 0.25 μm），氦气为载气（1 mL/min恒流模式）。进样口温度260°C，不分流阀关闭时间1分钟，脉冲压力分别设定为7、14、21、35和49 psi，脉冲持续50秒。低温捕集系统采用Trajan商业冷捕集装置（Part No. 093346），以液态CO₂直接冷却毛细管柱起始段，进样前1分钟启动，进样后1分钟关闭。化合物鉴定基于NIST/EPA/NIH质谱库（Version 2.2, 2014），匹配度（Match）和反匹配度（Reverse Match）≥750，并采用正构烷烃（C₇–C₃₀）计算线性程序升温保留指数（LRI）。所有测量均进行三次重复（n=3）。

三、研究结果

3.1 常规进样与低温捕集进样模式比较

研究人员首先在常规条件（无脉冲、无低温聚焦）下分析S. simplex花朵样本，获得40个色谱峰，总面积为1.23 × 10⁷，峰高较低且峰面积较小。引入低温捕集后，色谱图轮廓显著改变，许多化合物获得更窄的峰，分离效率和峰容量提高，检测到115个峰，绝对面积总和达1.32 × 10⁸。常规条件下观察到分裂峰现象（如己醛出现多重峰），这是不分流进样中空间谱带展宽的常见结果——分析物未能在毛细管起始端均匀冷凝时，会沿固定相分散成多个液滴，产生差异迁移，导致同一物质出现两个或多个峰。低温聚焦使注入的总质量更高效地转移至色谱柱并有效聚焦，克服了扩散导致的峰重叠或进样期间质量转移不良。2-辛烯醛（LRI 1055）的面积增益接近40倍（1.4 × 10⁶ vs 37,000），其常规条件下的分裂峰中较小面积峰被归属为2-辛烯醛，而较大面积峰与另一组分（可能为反式-阿布苏酮）重叠，后者在低温捕集分析中被成功鉴定。

研究人员定义了三个量化指标：面积增加百分比（PIA）、峰宽缩减百分比（PRW）和灵敏度增加百分比（PIS，定义为优化条件下峰高与常规条件下峰高之比×100）。由于色谱方法的检测限（LOD）和定量限（LOQ）主要由信噪比（S/N）决定，峰高代表信号强度，因此PIS值直接反映方法检测阈值和灵敏度的相对改善。低温捕集在整个保留区间（LRI 800–1400）系统性地缩减峰宽，表明该技术对高挥发性VOCs和中等挥发性化合物均具有稳健性。此外，常规方法的匹配因子主要在710至912之间，而低温捕集系统将该指标提升至840至959，反匹配值最高达987，确认低温谱带聚焦不仅增强信号强度，还产生更纯净的质谱图，降低了分析不确定性。

对于薰衣草精油样本，常规条件下获得128个峰，总绝对面积2.36 × 10⁸；引入低温聚焦后检测到136个峰，总响应面积提高1.35倍（3.18 × 10⁸）。主要化合物芳樟醇和乙酸芳樟酯在两种条件下均出现过载现象，这是其高丰度和纤维吸附导致的非线性分配所致。低温捕集对后期洗脱化合物的优势不明显，但对早期洗脱化合物的分辨率改善显著。

3.2 压力脉冲进样结合低温捕集进样模式

研究人员进一步考察了不同脉冲压力（7、21、35、49 psi）在有和无低温捕集条件下的效果。对于薰衣草精油，有低温捕集时样品转移呈非线性增加，在35 psi达到最大值，随后在更高压力下下降，这可能归因于反闪效应（backflash effect）——蒸气样品体积使进样室饱和。35 psi脉冲结合低温捕集比无脉冲低温捕集有效1.66倍，比无脉冲无低温捕集有效1.35倍，最终获得145个峰和3.91 × 10⁸总绝对面积。无低温捕集时，随着脉冲压力增加出现反闪歧视，原因在于缺乏低温聚焦加速样品在毛细管起始端的冷凝，从而增大了进样室内膨胀样品蒸气的体积。

对于S. simplex样本，有低温捕集且无脉冲压力的条件比无低温捕集有效10.75倍。脉冲进样会促进VOCs的反闪歧视，但在无低温捕集时高脉冲压力（35和49 psi）下也有一定效果。两种样本分析增益差异的原因在于：S. simplex花朵的VOCs在整个色谱图中分布更均匀，而薰衣草精油以芳樟醇和乙酸芳樟酯为主要成分（分别占总面积的31%和21%）。高挥发性VOCs快速饱和顶空，易于被SPME纤维聚合物萃取，而中等挥发性VOCs需要更多能量和时间迁移至气相并被萃取，以及从进样口解吸。方法精密度通过三次重复测量确认，峰面积相对标准偏差（RSD）在2.6%至9.0%之间，保留时间RSD低于2%。

3.3 最终考虑

脉冲不分流进样结合低温聚焦针对痕量或低丰度分析物的富集进行了优化。然而，主要化合物在毛细管柱固定相中具有较高相对浓度，会形成过载峰（前伸峰），峰最大值向更大保留时间移动，可通过标准分流进样解决，这是针对导致柱过载的主要组分需要峰对称性和线性时的推荐补充策略。前伸峰可能是低温聚焦和脉冲压力进样增加浓度的结果，但该方法对低丰度或痕量目标分析物尤为有利。低温捕集的有效性取决于多个参数：进样系统萃取和解吸的蒸气样品体积、进样室衬管的内体积（长×内径）、压力脉冲及其施加时间、毛细管管内体积、冷却传递至毛细管管的效率、预冷和冷却时间、固定相膜厚及其化学性质、柱流速等。本研究中低温捕集时间设为进样前1分钟至进样后1分钟共2分钟窗口，基于系统热动力学确定：进样前1分钟确保冷却区完全热稳定，进样后1分钟为捕集分析物快速定量解吸提供足够热能。值得注意的是，增加脉冲压力可能对SPME纤维的聚合物固定相产生磨损，高载气流速的摩擦可能使其劣化或从支撑体上脱落，长期纤维涂层稳健性需未来专门研究。

四、结论

本研究证明，优化SPME-GC–MS系统中的进样步骤对于改进挥发性有机化合物（VOCs）的分析至关重要。不分流脉冲进样与低温聚焦（低温捕集）的联合应用显著克服了常规方法的局限性，通过最大化分辨率，使样品向毛细管柱的转移率提高达65%，并避免了高挥发性分析物的损失和共流出——这是使用常规初始柱温（≥40°C）时的常见问题。两种技术之间的协同作用可最大限度地减少热不稳定化合物的降解并减少谱带展宽，从而在色谱柱中引入窄谱带。该方法提供了具有优异分辨率的色谱图，峰更窄更尖锐，质谱图更干净更精确，分离效率和峰容量显著提高，检测限随灵敏度改善而降低。优化后的方法可作为一种稳健且高灵敏度的痕量定性和定量分析工具，可实现高复杂度实际应用，特别是活性气味基质中成分的精确鉴定以及各种生物基质中挥发性生物标志物的测定，为研究、代谢监测和非侵入性病理诊断开辟了有价值的视角。